• Open Access

Fluoreszenznanoskopie einzelner DNA-Moleküle mit Fluoreszenzverhinderung durch stimulierte Emission (STED)

Authors

  • Dr. F. Persson,

    1. Fakultät für Physik, Universität Göteborg, Fysikgränd 3, 412 96 Göteborg (Schweden)
    Search for more papers by this author
    • Diese Autoren haben zu gleichen Teilen zu dieser Arbeit beigetragen.

  • P. Bingen,

    1. Abteilung Optische Nanoskopie, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg (Deutschland), Fax: (+49) 6221-54-51210
    Search for more papers by this author
    • Diese Autoren haben zu gleichen Teilen zu dieser Arbeit beigetragen.

  • Dr. T. Staudt,

    1. Abteilung Optische Nanoskopie, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg (Deutschland), Fax: (+49) 6221-54-51210
    Search for more papers by this author
  • Dr. J. Engelhardt,

    1. Abteilung Optische Nanoskopie, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg (Deutschland), Fax: (+49) 6221-54-51210
    Search for more papers by this author
  • Prof. J. O. Tegenfeldt,

    1. Fakultät für Physik, Universität Göteborg, Fysikgränd 3, 412 96 Göteborg (Schweden)
    Search for more papers by this author
  • Prof. Stefan W. Hell

    Corresponding author
    1. Abteilung Optische Nanoskopie, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg (Deutschland), Fax: (+49) 6221-54-51210
    • Abteilung Optische Nanoskopie, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg (Deutschland), Fax: (+49) 6221-54-51210
    Search for more papers by this author

  • Diese Arbeit wurde durch das 7. EU-Rahmenprogramm (7RP/2007-2013; Fördernummer 201418 (READNA)), Fördermittel des schwedischen Forschungsrates (2007-584 und 2007-4454), eine Young-Investigators-Förderung vom HSFP (RGY0078/2007-C) und ein AFR-PhD-Stipendium vom Nationalen Forschungsfonds, Luxemburg (TR-PHD BFR08-059) unterstützt. Wir danken Christoph Muus für das Vorbereiten von DNA-Proben sowie Patrick Hoyer und Matthias Reuss für die kritische Durchsicht der Übersetzung.

Abstract

original image

Scharfe Aufnahmen: STED-Nanoskopie (STED=stimulierte Fluoreszenzverhinderung) von einzelnen DNA-Strängen visualisiert Strukturen mit einer 5- bis 6fach höheren Auflösung als konfokale Mikroskopie (Konf), wie aus dem linken bzw. rechten Bild ersichtlich ist. Die STED-Technik enthüllt Strukturen der Größenordnung der DNA-Persistenzlänge (ca. 50 nm), ohne dabei in maßgeblicher Weise Photoschäden wie Bleichen oder DNA-Bruch zu verursachen.

Für die Lebenswissenschaften spielt die Fluoreszenzmikroskopie eine wichtige Rolle, obwohl ihre Auflösung lange auf Δr=λ/(2NA)>200 nm begrenzt war. (λ ist die Wellenlänge des Lichtes und NA die numerische Apertur des Objektivs.) Mitte der 1990er Jahre entstanden neue Mikroskopiekonzepte, die Auflösungen jenseits dieser Beugungsgrenze ermöglichen. Diesen Konzepten folgend schaltet man die Fluoreszenz des Farbstoffes so aus, dass Objekte, die näher als Δr zusammenliegen, gezwungen werden, nacheinander zu fluoreszieren.1, 2 Je nachdem, wie dieses Ausschalten umgesetzt wird, unterscheidet man zwei Gruppen: Die erste Gruppe umfasst unter anderem die STED-Mikroskopie (STED=Stimulated Emission Depletion, stimulierte Emissionslöschung);2 hier ist die Koordinate, an der Fluoreszenz erlaubt ist, durch ein Lichtmuster vorgegeben, das eine Intensitätsverteilung mit einer kontrollierbaren Nullstelle aufweist, z. B. ein Doughnut-Muster. Die zweite Gruppe ermöglicht Fluorophoren stochastisches Emittieren im Raum in der Weise, dass innerhalb eines Durchmessers von λ/(2NA) nur ein einzelner Fluorophor leuchtet. Die Emissionskoordinate wird dann bestimmt, indem man die Fluoreszenz auf eine Kamera abbildet, gefolgt von einer Schwerpunktsberechnung.3, 4 In beiden Gruppen sind Abbildungen unterhalb der Beugungsgrenze möglich, indem man nacheinander eine repräsentative Zahl von Farbstoffmolekülen des Objekts fluoreszieren lässt und nachweist.1

Während einige dieser Techniken bereits auf DNA-Systeme angewendet wurden, gelang bisher noch keine qualitativ hochwertige Nanoskopie an DNA-Molekülen.57 Dies ist bedauerlich, da viele Funktionen (wie die Genexpression) dafür bekannt sind, durch Biegen, Schleifenbildung, Supercoiling und anderen Konformationsänderungen reguliert zu werden, und zwar auf Längenskalen unterhalb der Beugungsgrenze.8 Viele Konformationsänderungen der DNA geschehen im Bereich von 100 bis 1000 Basenpaaren, entsprechend 35 bis 350 nm, mit der Persistenzlänge von DNA (normalerweise ca. 50 nm) als grundlegender Längenskala. Um Konformationsänderungen und Variationen der DNA zu untersuchen, muss man sicherstellen, dass die vorgegebene Struktur nicht nur durchgehend gefärbt, sondern auch durchgehend detektiert wird. Insbesondere muss zwischen zusammenhängenden DNA-Strängen, in mehrere Teilstücke zerbrochenen Strängen und Anordnungen aus mehreren überlagerten Strängen unterschieden werden können.9

Diese Anforderungen an die optische Nanoskopie von DNA-Strängen, die mit handelsüblichen interkalierenden Farbstoffen wie YOYO-1 (YOYO) gefärbt sind, lassen vermuten, dass die deterministische Natur der STED-Nanoskopie einen grundlegenden Vorteil gegenüber dem stochastischen Ansatz, der “stochastic ground state depletion followed by individual molecule return” (GSDIM, später auch dSTORM genannt), hat.1012 Während bei der STED-Nanoskopie wenige Photonen aus der Probe ausreichen, um ein Molekül zu identifizieren, hängt die Auflösung stochastischer Techniken im Wesentlichen quadratisch von der Zahl der Photonen ab. Die Genauigkeit wird weiter verringert, wenn Farbstoffmoleküle mit festem Dipolmoment nicht genau im Fokus liegen;13 für YOYO-Moleküle ist dies nicht unwahrscheinlich, da ihr Übergangsdipolmoment durch Interkalation an helikale DNA gekoppelt ist.14 Zudem führt eine Grundzustandsentvölkerung dazu, dass der Farbstoff in einen reaktiveren Zustand gepumpt wird.1012 Dies hat möglicherweise Schädigungen oder Brüche der DNA-Stränge zur Folge (z. B. durch Elektronentransfer),57 liegt aber der GSDIM-Methode zugrunde. Im Unterschied dazu ist STED so konzipiert, dass das Molekül in den Grundzustand gepumpt wird und so vor Photoreaktionen geschützt sein sollte.15 Um sicherzustellen, dass bei GSDIM nur ein Fluorophor von einem dunklen in einen hellen Zustand innerhalb eines beugungsbegrenzten Volumens übergeht, muss man letztlich die Farbstoffkonzentration an die Lebensdauer des Dunkelzustandes anpassen. Dies ist schwierig, weil der Farbstoff-DNA-Komplex viele Dunkelzustände entlang des DNA-Stranges annehmen kann.57 Wenn diese Bedingung aber nicht erfüllt ist, erfolgt die Abbildung der DNA-Stränge und -Konformationen nicht durchgehend bzw. unzuverlässig. Dies gilt besonders für Punkte, an denen Biegungen und Schleifenbildung auftreten; hier ist eine nanoskalige Auflösung besonders wichtig. Aus all diesen Gründen haben wir uns dazu entschlossen, einzelne DNA-Moleküle mit STED-Nanoskopie zu untersuchen.

Bei der von uns eingesetzten STED-Nanoskopie wird ein gepulster Anregungsstrahl mit einem Doughnut-förmigen STED-Strahl überlagert. Dieser verbietet es allen Farbstoffmolekülen, die dem Anregungslicht ausgesetzt sind, zu fluoreszieren, mit Ausnahme derjenigen, die im Zentrum des Doughnuts liegen. Durch Rastern der zeitlich gekoppelten Strahlen über die Probe werden die Details des fluoreszierenden Objekts zeitlich nacheinander aufgenommen.

Die Bilder wurden mit zwei unterschiedlichen, gepulsten STED-Wellenlängen (568 und 647 nm) aufgenommen. Der asymmetrische, dimere Cyaninfarbstoff YOYO wird wegen seiner Helligkeit und der 500fachen Fluorenszenzerhöhung nach Interkalation häufig für Einzelmolekül-DNA-Studien verwendet. Allerdings neigen interkalierende Cyaninfarbstoffe dazu, Lichtschäden an DNA-Farbstoff-Komplexen zu fördern, was sich in erhöhtem Bleichen und Brechen der DNA (Photonicking) bemerkbar macht. Photonicking kann drastisch reduziert werden, indem Sauerstoff aus dem Puffer entfernt wird. Die Wirkung von Sauerstoff auf das Bleichen bleibt bislang jedoch unklar; die Oxidation der DNA-Basenpaare trägt vermutlich zur Bleichwirkung bei.16 Wir fanden heraus, dass die Zugabe von β-Mercaptoethanol (BME) sowohl Photonicking als auch Bleichen reduziert. In den STED-Aufnahmen wurde festgestellt, dass die höchste Photostabilität bei Aufnahmen mit 20–50 Photonen pro Pixel (mit einer Pixelgröße von ca. 25 nm) bei einer Pixelintegrationszeit von 100 μs erreicht wurde.

Mit einem STED-Strahl bei 568 nm erhalten wir eine 5–6-mal bessere Auflösung gegenüber derjenigen von normaler, konfokaler Mikroskopie (Abbildung 1), die ihrerseits bereits eine deutliche Verbesserung bezüglich Kontrast und Auflösung gegenüber der Epifluoreszenzmikroskopie (Abbildung 2 c) bietet. Man beachte die Übereinstimmung in der Variation der Intensität entlang der DNA-Stränge zwischen den STED- und den konfokalen Bildern (Abbildung 1). Um zu untersuchen, über welchen Wellenlängenbereich STED noch wirksam ist, wurde STED an DNA auch bei 647 nm gemessen, wo die Emissionsintensität von YOYO nur noch 3 % des Maximums beträgt. Dennoch ist die DNA 3–4-mal besser aufgelöst als bei herkömmlicher konfokaler Mikroskopie (Abbildung 2). Dies belegt die Anwendbarkeit von STED über einen Bereich von 80 nm. Knicke entlang der DNA können durch eine spezifische DNA-Sequenz oder durch die Bindung von Proteinen oder kleinen Molekülen auftreten. Abbildung 2 zeigt, dass STED diese feinen Strukturen auflösen kann, die konfokaler Mikroskopie verborgen bleiben.

Figure 1.

a) Konfokale Abbildung von mit YOYO gefärbter λ-DNA (Basenpaar/Farbstoff 5:1) mit b) dem entsprechenden STED-Bild (Rohdaten). Das STED-Bild ist vor dem konfokalen aufgenommen worden. Maßstab: 1 μm. c) Durchschnitt dreier Linienprofile aus dem STED- (durchgezogene, rote Linie) und dem konfokalen Bild (gestrichelte, schwarze Linie). Die Linienprofile entstammen der Position der weißen Linien in den obigen Bildern. Die drei deutlichen Spitzen mit unterschiedlichen DNA-Molekülen werden nur mit STED aufgelöst.

Figure 2.

Typische STED-Rohdaten-Bilder von mit YOYO gefärbter λ-DNA (Basenpaar/Farbstoff 5:1) unter Anwendung von a) λSTED=568 nm und b) λSTED=647 nm. Maßstab in (a) und (b): 1 μm. c) Eine Kurve zeigt den Durchschnitt von elf Linienprofilen eines einzigen DNA-Strangs, mit zugehörigen Profilen der Epifluoreszenz (gepunktete, hellgraue Linie), konfokalen (gestrichelte, schwarze Linie) und STED-Nanoskopie mit λSTED=647 nm (strichgepunktete, blaue Linie) und 568 nm (durchgezogene, rote Linie); die entsprechenden Halbwertsbreiten wurden durch Anlegen von Ausgleichskurven zu (300±11) nm (Gauß), (238±5) nm (Gauß), (62±2) nm (Lorentz) bzw. (42±3) nm (Lorentz) bestimmt. Die Fehlerbalken entsprechen einer Standardabweichung. Beispiele von DNA-Segmenten mit Biegungen und Knicken, die sichtbar im STED-Bild unter Anwendung von e) λSTED=647 nm und g) λSTED=568 nm, jeweils aber nicht auflösbar in den entsprechenden konfokalen Bildern (d) und (f) sind. Maßstab in (d)–(g): 500 nm.

Zur Untersuchung der komplexen Lichtschäden, die der DNA durch den STED-Strahl zugefügt werden (Basenpaar/Farbstoff 5:1), wurden nacheinander ein konfokales Bild, ein STED-Bild und ein weiteres konfokales Bild aufgenommen (λSTED=568 nm). Während das zweite konfokale Bild eine (50±9) % niedrigere Fluoreszenz durch Bleichen aufweist, wurde weder im STED noch in der zweiten konfokalen Aufnahme Photonicking beobachtet. Eine weitere Serie mit drei aufeinander folgenden konfokalen Bildern zeigte eine Verringerung des Fluoreszenzsignals um (34±16) %. STED hat zwar eine Bleichwirkung, die sich aber kaum von der bei einer gewöhnlichen, konfokalen Messung unterscheidet. Weitere Einzelheiten bezüglich STED-Messungen mit einem niedrigeren Farbstoff/DNA-Verhältnis (kompatibel mit Einzelmoleküluntersuchungen von DNA-Protein-Interaktionen) finden sich in den Hintergrundinformationen.

Wir haben hier gezeigt, dass STED-Nanoskopie Aufnahmen von DNA bei einer Auflösung von ca. 45 nm ermöglicht. Dieser Wert ist vergleichbar mit der Persistenzlänge freier DNA, einer grundlegenden Längenskala der Polymerphysik. Die Variation des Fluoreszenzsignals entlang des DNA-Moleküls stimmt gut mit der von konfokaler Mikroskopie überein. Dies belegt die Anwendbarkeit von STED auf die Bildgebung einzelner DNA-Moleküle und eine künftige mögliche Verwendung für die Untersuchung von Signalvariationen, die aus sequenzspezifischer Farbstoffbindung oder teilweises Schmelzen der DNA resultieren. Die von uns gezeigte Kombination von Hochauflösung und Durchgängigkeit des Signals ist von entscheidender Bedeutung für die Visualisierung kleiner Konformationsänderungen sowie für die optische Abbildung von DNA.9 Außerdem konnten wir zeigen, dass STED über einen relativ breiten Wellenlängenbereich (mindestens 80 nm) angewendet werden kann. Bei größeren Wellenlängen werden in der Regel weniger Lichtschäden induziert, die Auflösungsverbesserung ist gleichwohl noch deutlich. Da die STED-Technik auf molekularen Übergängen zwischen den beiden grundlegenden Zuständen eines Fluorophors, d. h. dem Grundzustand und dem ersten elektronisch angeregten Zustand, beruht, erwarten wir, dass sie sich zur bevorzugten Methode für die optische Erforschung der DNA auf molekularer Ebene entwickeln wird.

Experimentelles

λ-Bakteriophagen-DNA (Amersham Biosciences) wurde mit YOYO-1 (Invitrogen) gefärbt, mit einem Basenpaar/Farbstoff-Verhältnis von 5:1 und 20:1. Vor den Experimenten wurde die gefärbte DNA auf 1 μg mL−1 mit entgastem 0.5× Tris-Borat-EDTA(TBE)-Puffer und 5% (v/v) β-Mercaptoethanol (Sigma Aldrich) verdünnt und auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen gestreckt. Details siehe Hintergrundinformationen.

Die Anregung der DNA erfolgte mit einer gepulsten Laserdiode (PicoQuant) mit Emission bei λAnregung=470 nm mit einem Spitzenbestrahlungswert von 15–65 kW cm−2 in der Probe (durchschnittliche Leistung von 1–4 μW), synchronisiert mit einem STED-Laser bei λSTED=568 und 647 nm über eine schnelle Photodiode (OCF-401; Becker & Hickl GmbH). Der STED-Strahl wurde mit einem aktiv modengekoppelten (APE) Krypton-Laser (Coherent Inc.) erzeugt, mit Pulsbreiten von 1.5 ns (568 nm) und 300 ps (647 nm) bei einer Wiederholrate von 71.25 MHz und Höchstbestrahlungen von 20–30 MW cm−2 (568 nm) und 210–360 cm−2 MW (647 nm) in der Probe (Durchschnittsleistung von 45–70 mW (568 nm) oder 130–220 mW (647 nm)). Eine Vortex-Phasenplatte (RPC Photonics) wurde verwendet, um den für STED notwendigen Doughnut zu generieren. Die Anregungs-und STED-Strahlen wurden mit akustooptischen Filtern (Crystal Technologies) kombiniert und in ein Stativ (DMI 4000B; Leica Microsystems GmbH) eingekoppelt, das mit einem 63×(NA 1.30, Leica)-Ölimmersionsobjektiv und einem Drei-Achsen-Piezo-Scanner (PI) ausgestattet ist. Die emittierte Fluoreszenz wurde durch einen Band-Pass-Filter (HQ510/40M; Chroma) gefiltert und konfokal mit einer Avalanche Photodiode (SPCM-AQR-13-FC; PerkinElmer) und einer Datenerfassungs-Software (ImSpector, MPI Biophysikalische Chemie Göttingen) detektiert. Die Pixelgrößen betrugen 25 und 40 nm für λSTED=568 bzw. 647 nm bei einer Pixelintegrationszeit von 100 μs. Die entsprechenden konfokalen Bilder wurden mit den gleichen Parametern aufgenommen.