• Open Access

Raman-spektroskopische Detektion von Anthrax-Endosporen in Pulverproben

Authors

  • S. Stöckel,

    1. Institut für Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Helmholtzweg 4, 07743 Jena (Deutschland)
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  • S. Meisel,

    1. Institut für Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Helmholtzweg 4, 07743 Jena (Deutschland)
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  • Dr. M. Elschner,

    1. Friedrich Loeffler Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, Naumburger Straße 96a, 07743 Jena (Deutschland)
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  • Dr. P. Rösch,

    1. Institut für Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Helmholtzweg 4, 07743 Jena (Deutschland)
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  • Prof. Dr. J. Popp

    Corresponding author
    1. Institut für Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Helmholtzweg 4, 07743 Jena (Deutschland)
    2. Institut für Photonische Technologien, Albert-Einstein-Straße 9, 07745 Jena (Deutschland)
    • Institut für Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-Universität Jena, Helmholtzweg 4, 07743 Jena (Deutschland)
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  • Wir danken dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (Deutschland) für die Förderung der Forschungsprojekte “Pathosafe” (FKZ 13N9547 und FKZ 13N9549) und “RamaDek” (FKZ 13N11168), der Thüringischen Exzellenzinitiative (TMBWK) für die Förderung des “MikroPlex”-Projekts (PE113-1) und der EU (EAHC Agreement – No 2007 204).

Abstract

original image

Ein kombiniertes Analyseverfahren aus Raman-Spektroskopie und Chemometrie wurde entwickelt, das zuverlässig Anthrax-Endosporen in Umweltproben aufspüren kann. Ohne zeitaufwändige Anreicherungsschritte ist es möglich, weniger als 1 μg Anthrax-Endosporen z. B. in 1 g Backpulver innerhalb von 3 h zu detektieren und von anderen, nicht-pathogenen Bacillus-Arten mit Genauigkeiten um 99 % zu unterscheiden.

Gilt es, Mikroorganismen in komplexen Proben wie “weißen Pulvern”, Lebensmitteln oder Erde nachzuweisen, findet häufig die Polymerasekettenreaktion (PCR) Anwendung.1 Meistens allerdings verhindern Inhibitoren in den Proben selbst, dass eine direkte Analyse mittels PCR möglich ist.2 So ist es oft zwingend erforderlich, zuvor die Bakterienkulturen anzureichern, was sich bei anspruchsvollen Mikroorganismen als sehr zeitaufwändig erweisen kann. Alternativ bietet sich eine Extraktion sämtlicher DNA an, wobei hier die Probenaufarbeitung stark von der Art der Matrix abhängig ist, um reproduzierbare DNA-Ausbeuten zu erzielen.2, 3

Verlegt man sich auf die Analyse von intakten Einzelbakterien, so ist eine Anreicherung der Biomasse ebenso wie eine Extraktion bestimmter Zellbestandteile obsolet.4 Diesen Vorteil macht sich die Raman-Mikrospektroskopie mit einer Anregung im sichtbaren Spektralbereich zu Eigen. Hierbei wird der gesamte Organismus durch sein Raman-Spektrum charakterisiert, da Informationen aus dem Zytoplasma, der Zellmembran und der Oberfläche der Zellen einfließen. Bakterien lassen sich so mittels ihrer spektralen Fingerabdrücke identifizieren, indem diese mit Referenzspektren anderer Bakterien gleicher oder ähnlicher Spezies verglichen werden. So ist die Detektion von Keimen in verschiedensten zivilen und militärischen Feldern möglich, wie beispielsweise die des endosporenbildenden Erregers des Milzbrandes (Anthrax), Bacillus anthracis.5 Das Aufspüren von Bacillus-Endosporen mittels Raman-Spektroskopie in komplexen Matrices und Briefsendungen wurde bereits in einzelnen Publikationen behandelt, wobei aber ausschließlich das endosporenspezifische Salz Calciumdipicolinat (CaDPA) detektiert wurde.6 Dieser Ansatz hat allerdings den inhärenten Nachteil, dass nicht-pathogene Bazillen nicht von B.-anthracis-Endosporen unterschieden werden können.

Daher wenden wir zum ersten Mal die Raman-Spektroskopie an, um Anthrax-Endosporen in Umweltproben und der gleichzeitigen Gegenwart anderer Bacillus-Arten zu detektieren und zu identifizieren. Wir schlagen dafür einen Arbeitsablauf vor, der mit minimalem Zeit- und Materialaufwand bereits drei Stunden nach Probenahme Resultate generiert: Zuerst wird die kontaminierte Probe (ca. 100 mg) eine Stunde mit Formaldehyd behandelt, um mögliche Pathogene zu inaktivieren.7 Danach erfolgt die Extraktion der Sporen mittels einer Dichtegradientenzentrifugation innerhalb von 30 Minuten, ehe ein Mikroliter der Endsuspension auf einem Quarzsubstrat getrocknet und mit einem Raman-Mikrospektrometer (532 nm, 6 s pro Einzelspore) vermessen wird.8 Die erhaltenen Raman-Spektren werden zuletzt mithilfe chemometrischer Verfahren und spektraler Datenbanken analysiert.

Besonderes Augenmerk gilt pulverförmigen Substanzen, da sie zu den am häufigsten auf B. anthracis zu testenden, nicht-klinischen Proben gehören.9 Wir wählten ein breites Spektrum an sieben Haushaltspulvern (Backpulver, Gips, Milchpulver, Natron, Schmerztabletten, Vogelsand, Waschmittel) und versetzten diese mit Endosporen zweier B.-anthracis-Stämme sowie vier weiterer Bacillus-Arten: Die genetisch eng verwandten B. anthracis, B. mycoides und B. thuringiensis gehören dabei zur Bacillus-Cereus-Gruppe, welche in PCR-Ansätzen zuweilen verwechselt wurden.10 Entferntere Spezies sind die Erdbakterien B. megaterium und B. subtilis.

Der LD50-Wert von Anthrax-Aerosol gegenüber Menschen wurde nach Experimenten an Javaneraffen auf 8000 bis 50 000 koloniebildende Einheiten (KbE) taxiert, was ungefähr 8–50 ng Endosporen entspricht.11 Um zu überprüfen, ob die ausgewählte Isolierungstechnik ausreichend empfindlich ist, haben wir definierte Mengen an Sporen in Backpulver- und Vogelsandproben inokuliert. Dazu wurden beide Matrices mit lebenden B.-thuringiensis-Endosporen in Konzentrationen von 108, 106, 104 und 103 KbE pro Gramm Matrix versetzt. Nach dem Extraktionsschritt wurden die isolierten Endosporen ausgezählt (Tabelle S1 in den Hintergrundinformationen): 1–12 % der vorgelegten Bakterien wurden zurückgewonnen, was ausreichend für mindestens 100 Sporen pro Probe ist, womit belastbare Resultate in den folgenden Raman-Messungen erzielt werden können. Dazu wurde 1 μL jeder verarbeiteten Probe Raman-mikrospektroskopisch auf Einzelzellebene analysiert, wie es in Abbildung 1 anhand einer mit B. anthracis Sterne versetzten Backpulverprobe demonstriert wird. Das Sichtfeld unter Dunkelfeldbeleuchtung wurde zur Erfassung und Beurteilung der Partikel hinsichtlich ihrer Morphologie binärisiert. Die fünf in Abbildung 1 b markierten Teilchen wurden dann gemessen und ergaben die unbearbeiteten Raman-Spektren in Abbildung 1 c (i–iv: Endosporen, v: Polyhydroxybutyrat, ein bakterieller Speicherstoff). Derart wurden ungefähr 50 Partikel pro Probe mit einer Integrationszeit von jeweils 5 s plus 1 s Vorbrennzeit vermessen. Letztere wurde appliziert, um mögliche, allenfalls geringe Beiträge durch Fluoreszenz zu minimieren.

Figure 1.

Partikelanalyse einer mit B. anthracis Sterne versetzten Backpulverprobe. a) Sichtfeld unter Dunkelfeldbeleuchtung. b) Im Binärbild erfüllen fünf Partikel (i–v) die morphologischen Kriterien einer Bakterienzelle. c) Unbearbeitete Raman-Spektren der Partikel i–v. Das Sternchen markiert eine Bande des Quarzglassubstrats.

Abbildung 2 a präsentiert Mittelwertspektren einer jeden analysierten Bacillus-Art. Hervorstechende Merkmale sind die vom endosporenspezifischen Salz CaDPA hervorgerufenen Signale bei 657, 1013 und 1397 cm−1. Andere spektrale Beiträge entstammen von Proteinen bei 1001 cm−1 (Ringatmungsschwingung von Phenylalanin) oder 1659 cm−1 (Amid I) ergänzt durch Signale von Nukleinsäuren wie 781 cm−1 (Ringschwingung von Cytosin/Uracil). Andere Banden hingegen ergeben sich durch Überlagerungen von Signalen unterschiedlicher Biomoleküle mit CaDPA-Banden, etwa bei 821 cm−1 die Ringatmungsschwingung von Tyrosin mit der CaDPA-Carboxylat-Streckschwingung; oder aber bei 1450 cm−1 die CH2/CH3-Deformationsmoden von Proteinen und Lipiden sowie bei 1578 cm−1 die Ringschwingungen von Guanin und Adenin mit den Pyridinringschwingungen des CaDPA. Das intensive Signal bei 2939 cm−1 ist den (as)symmetrischen CH-Streckschwingungen von überwiegend Proteinen und Fetten zuzuordnen.12

Figure 2.

Raman-Spektren von Bacillus-Endosporen und verschiedener Matrixpartikel. a) Hintergrundkorrigierte Mittelwert-Raman-Spektren von B. anthracis (i, berechnet aus 997 Einzelsporen-Spektren), B. megaterium (ii, 1420 Spektren), B. mycoides (iii, 1142 Spektren), B. subtilis (iv, 1217 Spektren) und B. thuringiensis (v, 947 Spektren). Das Sternchen markiert eine Bande des Quarzglassubstrats. b) Raman-Spektren von Teilchen aus Milchpulver (i, Milchfett), Backpulver (ii, Stärke), Vogelsand (iii, Quarz), Natron (iv, Natriumhydrogencarbonat), Gips (v, Calciumsulfat-Dihydrat), Schmerztabletten (vi, Acetylsalicylsäure) und Waschpulver (vii, Kupferphthalocyanin). Die Spektren wurden zur besseren Übersicht skaliert und vertikal verschoben angeordnet.

Sind in bestimmten Proben nur wenige Bakterien präsent, so ist eine ungewollte Messung biotischer und abiotischer Matrixpartikel mit Endosporenmorphologie unvermeidbar. Diese Spektren können sich negativ auf die statistische Auswertung auswirken, da unmöglich von jedem Matrixmaterial ein Referenzspektrum in der Datenbank hinterlegt sein kann. Abbildung 2 b repräsentiert eine Auswahl an Raman-Spektren von Matrixpartikeln, die während der Messungen registriert worden sind. Deutlich sichtbar sind die Unterschiede zwischen den Spektren untereinander, aber auch verglichen mit denen der Endosporen in Abbildung 2 a, was ein frühzeitiges Aussortieren dieser Spektren leicht ermöglicht.

Eine geeignete Datenauswertung nach Inaktivierung und Isolierung stellt den letzten Schritt des hier vorgestellten Konzeptes dar. Als Auswertealgorithmus wählten wir eine lineare Diskriminanzanalyse (LDA) aus, welche kürzlich zur Diskriminierung von Bakterien und anorganischen Teilchen anhand ihrer Raman-Spektren herangezogen wurde.13 Um das gegebene Problem zu lösen, muss der Klassifizierer so trainiert werden, dass er zwischen den Spektren der fünf Bacillus-Arten unterscheiden kann. Dazu wurden Endosporenspektren bekannten Ursprungs mit dem Algorithmus so ausgewertet, dass Diskriminanzfunktionen berechnet werden konnten, die eine maximale Unterscheidbarkeit zwischen den fünf Klassen abbilden. Diese Spektren wurden wie folgt erstellt: Von jeder nicht-pathogenen Bacillus-Art wurden mindestens 10 unabhängig kultivierte Batches präpariert und entweder direkt aus dem Kultivierungsmedium entnommen oder für wenigstens 24 h in die verschiedenen Pulver inokuliert (B. anthracis nur Backpulver- und Vogelsandproben), danach inaktiviert, isoliert und schließlich jede Spezies-Matrix-Kombination zweimal Raman-spektroskopisch analysiert und chemometrisch ausgewertet. Dadurch entstand ein LDA-Modell mit insgesamt 5723 Raman-Spektren (Tabelle S2 a). Eine deutliche Partitionierung der Daten durch drei der vier Diskriminanzfunktionen zeigt Abbildung S1 auf. Zudem ergab eine Kreuzvalidierung der Daten eine Klassifizierungsgenauigkeit von 94.8 % (5427 Spektren wurden der korrekten Spezies zugeordnet, Tabelle S3). Die Mehrzahl der Falsch-Positiven trat zwischen B. mycoides und B. thuringiensis auf, ebenso die meisten der falsch zugeordneten B.-anthracis-Spektren. Offensichtlich ähneln sich die Spektren der Bacillus-Cereus-Gruppe stärker als die der anderen Arten.

Um den Fall zu simulieren, dass es unbekannte Umweltproben zu analysieren gilt, wurden weitere gespikte Proben mit neuen Batches der fünf Bacillus-Arten angefertigt. Dadurch kann gleichsam die Neigung des erstellten Modells zur Überanpassung geprüft werden. Wenn das Modell zu spezifisch an den Trainingsdatensatz angepasst wurde, kann es nur unzureichend neue Daten beurteilen. Ein Identifizierungsversuch des neuen Satz an 1650 Spektren “unbekannter Identität” (Tabelle S2 b) mittels des zuvor erstellten LDA-Modells resultierte in dem in Abbildung 3 a dargestellten Resultat: Nach Projektion der Spektren auf zwei der LD-Achsen bilden sich klar abgegrenzte Punktwolken pro Spezies, welche zudem mehrheitlich im LDA-Modell-Vertrauensintervall der jeweiligen Spezies (doppelte Standardabweichung, dargestellt als Ellipsen) liegen. Tabelle 1 gibt die Identifizierungsgenauigkeiten pro Spezies wieder; 96.8 % der Spektren wurden korrekt zugeordnet. Die höchsten bzw. niedrigsten Raten liegen bei B. subtilis (100 %) und B. thuringiensis (91.2 %) vor – bei B. anthracis wurde eine Empfindlichkeit von 99.6 % erreicht. Auch befanden sich sämtliche Fehlzuordnungen von B. anthracis, B. mycoides und B. thuringiensis genau in diesen drei Klassen. Es ist damit festzuhalten, dass die Genauigkeiten dieses Validierungsexperiments denen des LDA-Modells entsprechen, was für alle hier untersuchten Probentypen gilt, da offensichtlich keine der Matrices merklich Einfluss auf die Endosporen-Spektren nimmt.

Figure 3.

LDA-Score-Plot der Validierungsdaten. Die Ellipsen bilden das Konfidenzintervall (zweifache Standardabweichung) jeder Klasse ab. a) B. anthracis (rot), B. megaterium (cyan), B. mycoides (olivgrün), B. subtilis (blau) und B. thuringiensis (hellgrün). b) Die roten Kreuze stellen 191 Spektren von B.-anthracis-367-Endosporen dar, die aus einer dem Modell unbekannten Matrix (Kochsalz) isoliert wurden.

Table 1. Ergebnisse des Validierungsexperiments mit einem unabhängigen Datensatz.[a]

Identifiziert als[b]

Bant

Bmeg

Bmyc

Bsub

Bthu

Bant [C]

  1. [a] Angegeben sind die Empfindlichkeiten pro Art (Sens.). Die Gesamtgenauigkeit betrug 96.8 %. Die letzte Spalte gibt die Einordnung der Endosporen aus Kochsalz [C] an. [b] Bant=B. anthracis, Bmeg=B. megaterium, Bmyc=B. mycoides, Bsub=B. subtilis, Bthu=B. thuringiensis.

Bant

241

4

3

0

0

183

Bmeg Bmyc Bsub Bthu Sens. [%]

0 0 0 1 99.6

374 0 0 2 98.4

0 382 0 17 95.0

0 0 331 0 100

0 26 0 269 91.2

0 8 0 0 95.8

Wie aber kann das Modell eine Probe bisher unbekannter Matrix verarbeiten? Dafür wurden B.-anthracis-Endosporen in Kochsalz eingebracht und wie oben beschrieben verarbeitet. 191 Spektren konnten gemessen und mit dem LDA-Modell ausgewertet werden. Wie in Abbildung 3 b ersichtlich, finden sich fast alle (183/191, 95.8 %, Tabelle 1) Spektren in dem Raum wieder, der von den B.-anthracis-Modelldaten zuvor aufgespannt worden ist. Sämtliche Fehlzuordnungen sind bei B. mycoides zu finden. Aber es ist offensichtlich, dass zufriedenstellende Identifizierungsraten selbst dann erreicht werden können, wenn der Probentyp nicht zuvor im LDA-Modell integriert worden ist.

Die geringe Anfälligkeit der Methode gegenüber etwaigen Matrixeinflüssen ist bei nukleinsäurebasierten Detektionsmethoden wie der PCR nicht gegeben, welche vergleichsweise reine Proben benötigen. Ausgehend von vorkultivierten Organismen sind so sehr gute Ergebnisse durch die PCR zu erzielen, aber ein Einsatz der Methode zur Echtzeitdetektion von Pathogenen in Umweltproben zeitigte aufgrund einer Vielzahl möglicher Störsubstanzen bisher kaum Erfolge. Deshalb denken wir, dass der hier vorgestellte schwingungsspektroskopische Ansatz diese Unzulänglichkeiten der PCR gut kompensieren kann. Eine hohe Robustheit gegenüber Matrixeinflüssen sowie schnelle, sichere Ergebnisse nach drei Stunden machen eine Point-of-Care-Diagnostik von B. anthracis in Umweltproben möglich.

Experimentelles

Details der Methoden sind in den Hintergrundinformationen zu finden. Sämtliche Endosporen wurden durch einstündige Behandlung mit 20 %iger Formaldehyd-Lösung inaktiviert. Zur Isolation wurde als Dichtegradientenmedium eine Lösung Polyvinylpyrrolidon- beschichteter Silicagelpartikel in 0.15 M NaCl-Lösung verwendet. Eine Zellzahlbestimmung nach der Isolierung erfolgte über Ausplattierung und Koloniezählung. Raman-Spektren wurden unter Standardbedingungen mit 532-nm-Anregung mittels eines Raman-Mikrospektrometers aufgenommen, wobei die Proben auf Quarzglas mit 7 mW (ca. 1 μm Laserspot) 6 s lang bestrahlt wurden (1 s “Vorbrennen” und 5 s Integrationszeit). Alle chemometrischen Berechnungen wurden mit Gnu R ausgeführt.

Ancillary