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Keywords:

  • Aminosäuren;
  • Cycloadditionen;
  • Klick-Chemie;
  • Protein-Engineering;
  • Viruspartikel

Abstract

Die steigende Nachfrage nach fortschrittlicher Fluoreszenzmikroskopie und hochauflösenden bildgebenden Verfahren (SRM) erfordert die Entwicklung neuer Methoden zum Markieren von Proteinen mit kleinen, photostabilen Fluorophoren, wenn möglich mehrfarbig. Die Technologie zur Erweiterung des genetischen Codes ermöglicht den positionsspezifischen Einbau einer nichtnatürlichen Aminosäure (UAS) mit chemisch biokompatibel modifizierbaren funktionellen Gruppen in lebenden Zellen. Wir präsentieren das Design und die Synthese neuer UAS mit gespanntem Alken als nichtnatürlicher Funktionalität, die erhöhte Stabilität und verbesserte Einbauraten bei ausgezeichneter Reaktivität gegenüber Tetrazinen in Diels-Alder-Cycloadditionen (SPIEDAC) aufweisen. Darüber hinaus stellen wir eine fein abgestimmte, selektiv verbesserte SPIEDAC-Variante (seSPIEDAC) vor, die eine zu SPIEDAC orthogonale, effiziente und empfindliche Proteinmarkierung ermöglicht. Eine Kombination aus seSPIEDAC und SPIEDAC ermöglicht es uns, Proteine in lebenden Zellen mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu markieren. Wir demonstrieren das Potenzial dieser Methode anhand der Visualisierung des Insulinrezeptors (IR) sowie Virus-ähnlicher Partikel (VLP) mithilfe zweifarbiger, hochauflösender Mikroskopie.