Structural Insights into the Trp-Cage Folding Intermediate Formation

Authors

  • Petra Rovó,

    1. Laboratory of Structural Chemistry and Biology, Institute of Chemistry and Protein Modeling Group of HAS-ELTE, Eötvös Loránd University, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/A (Hungary)
    Search for more papers by this author
  • Pál Stráner,

    1. Laboratory of Structural Chemistry and Biology, Institute of Chemistry and Protein Modeling Group of HAS-ELTE, Eötvös Loránd University, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/A (Hungary)
    Search for more papers by this author
  • Dr. András Láng,

    1. Laboratory of Structural Chemistry and Biology, Institute of Chemistry and Protein Modeling Group of HAS-ELTE, Eötvös Loránd University, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/A (Hungary)
    Search for more papers by this author
  • István Bartha,

    1. Institute of Biology, Eötvös Loránd University, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C (Hungary)
    Search for more papers by this author
  • Kristóf Huszár,

    1. Institute of Mathematics, Eötvös Loránd University, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C (Hungary)
    Search for more papers by this author
  • Prof. Dr. László Nyitray,

    1. Department of Biochemistry, Institute of Biology, Eötvös Loránd University, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C (Hungary)
    Search for more papers by this author
  • Prof. Dr. András Perczel

    Corresponding author
    1. Laboratory of Structural Chemistry and Biology, Institute of Chemistry and Protein Modeling Group of HAS-ELTE, Eötvös Loránd University, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/A (Hungary)
    • Laboratory of Structural Chemistry and Biology, Institute of Chemistry and Protein Modeling Group of HAS-ELTE, Eötvös Loránd University, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/A (Hungary)
    Search for more papers by this author

Abstract

The 20 residue long Trp-cage is the smallest protein known, and thus has been the subject of several in vitro and in silico folding studies. Here, we report the multistate folding scenario of the miniprotein in atomic detail. We detected and characterized different intermediate states by temperature dependent NMR measurements of the 15N and 13C/15N labeled protein, both at neutral and acidic pH values. We developed a deconvolution technique to characterize the invisible—fully folded, unfolded and intermediate—fast exchanging states. Using nonlinear fitting methods we can obtain both the thermodynamic parameters (ΔHF–I, TmF–I, ΔCpF–I and ΔHI–U, TmI–U, ΔCpI–U) and the NMR chemical shifts of the conformers of the multistate unfolding process. During the unfolding of Trp-cage distinct intermediates evolve: a fast-exchanging intermediate is present under neutral conditions, whereas a slow-exchanging intermediate-pair emerges at acidic pH. The fast-exchanging intermediate has a native-like structure with a short α-helix in the G11–G15 segment, whereas the slow-exchanging intermediate-pair presents elevated dynamics, with no detectable native-like residue contacts in which the G11[BOND]P12 peptide bond has either cis or trans conformation. Heteronuclear relaxation studies combined with MD simulations revealed the source of backbone mobility and the nature of structural rearrangements during these transitions. The ability to detect structural and dynamic information about folding intermediates in vitro provides an excellent opportunity to gain new insights into the energetic aspects of the energy landscape of protein folding. Our new experimental data offer exceptional testing ground for further computational simulations.

Abstract

Számos in vitro és in silico feltekeredési tanulmány tárgyát képezte már kis méretének köszönhetően a mindössze 20 aminosavból felépülő Trp-kalitka mini-fehérje. Elsőként itt számolunk be és adunk atomi felbontású képet ezen természetes polimer több-lépésben történő feltekeredéséről. A 15N és 13C/15N jelölt fehérjék hőmérsékletfüggő NMR mérései alapján különböző köztes-állapokat figyeltünk meg és jellemeztünk mind semleges, mind savas pH-n. A spektrumok elemzésére egy új dekonvolúciós eljárást dolgoztunk ki, olyat amellyel egyaránt jellemezni tudtuk az egymással gyorsan cserélődő s ezért tiszta formáikban „láthatatlan“ fel- és letekeredett, valamint közbülső állapotokat. Egy alkalmas nem-lineáris illesztési módszert használva meghatároztuk a több-lépéses feltekeredési folyamat termodinamikai paramétereit (ΔHF–I, TmF–I, ΔCpF–I és ΔHI–U, TmI–U, ΔCpI–U), valamint a „láthatatlan” teljesen tiszta állapotok NMR kémiai-eltolódásértékeit. A Trp-kalitka feltekeredése során több megkülönböztethető közbülső állapot kialakulását tapasztaljuk. Semleges közegben egy, az NMR időskálán mérve gyorsan cserét mutató, míg savas közegben két lassabban cserélődő intermedier figyelhető meg. A gyorsan cserélődő köztiállapot térszerkezete hasonlít a natív térszerkezethez, a különbség mindössze a G11[BOND]G15 újonnan kialakuló α-helikális szegmensre korlátozódik. A lassan cserélődő intermedier belső dinamikájára nézve mozgékony, térszerkezetét tekintve majdnem teljesen rendezetlen. Itt a G11[BOND]P12 peptidkötés konformációja lehet akár cisz, akár transz térállású. Heteronukleáris relaxációs mérések, illetve molekuladinamikai szimulációk segítségével feltártuk a fehérjegerinc belső mozgékonyságának és a téralkat-átrendeződésnek molekuláris hátterét. Az a tény, hogy in vitro atomi szintű szerkezeti és dinamikai információk gyűjthetők a Trp-kalitka minifehérje intermedierjeiről egyben explicit utalást is ad arról, hogy milyen is e fehérje-feltekeredésének potenciális energiafelülete. Az általunk most bemutatott kísérleti eredmények további in silico szimulációkhoz szolgáltatnak értékes adatsorokat.

Ancillary