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Collagenase-2 (MMP-8) and collagenase-3 (MMP-13) in adult periodontitis: molecular forms and levels in gingival crevicular fluid and immunolocalisation in gingival tissue

Authors


Abstract

Aim: To determine the cellular and molecular forms of MMP-8 (collagenase-2) and MMP-13 (collagenase-3) associated with chronic adult periodontitis by examining the species present in gingival crevicular fluid (GCF) and enzyme distribution in gingival tissue.

Methods: 30-s GCF samples were collected directly from the periodontal pockets of 12 untreated patients using filter paper strips. After elution into buffer, the samples were examined by Western immunoblotting with polyclonal antibodies for MMP-8 and MMP-13 and quantification by scanning image analysis. Individual band intensities were expressed as a percentage of total sample absorbance and mean patient values were calculated. Gingival tissue from 6 patients was fixed in formalin and embedded in paraffin wax. MMP-8 and MMP-13 were localised using the same antibodies and an avidin-biotin-peroxidase detecting system. Double staining was performed with a contrasting substrate reaction.

Results: The majority of MMP-8 staining in pre-treatment GCF was present in 80, 75 and 60 kD bands corresponding to prepro-, pro- and active forms of PMN-type enzyme. 43 and 38 kD bands evidently represented active, fibroblast-type MMP-8. Immunoreactivities at >100 kD and leqslant R: less-than-or-eq, slant30 kD were probably enzyme-inhibitor complex and degraded fragments, respectively. MMP-13 was seen mainly as 60 kD proenzyme with some 40 kD active enzyme and a small proportion of >100 kD complex. The percentages of MMP-8 PMN-type enzyme and MMP-13 proenzyme bands correlated significantly with gingival and bleeding indices (p<0.05). Immunohistochemistry demonstrated MMP-8 in PMNs, sulcular epithelial and also plasma cells in inflamed gingival connective tissue. MMP-13 immunoreactivity was detected in the sulcular epithelium and in macrophage-like cells.

Conclusion: Multiple species and elevated levels of both MMP-8 and MMP-13 from many rather than single cellular sources in the diseased periodontium are identified in untreated periodontitis GCF and active forms contribute to GCF collagenase activity.

Zusammenfassung

Ziel: Um die zellulären und die Molekülformen von MMP-8 (Kollegenase-2) und MMP-13 (Kollegenase-3), die mit der chronischen Erwachsenenparodontitis zu bestimmen, wurden die Spezies, die im gingivalen Sulkusfluid (GCF) vorhanden sind und die Enzymverteilung im Gingivagewebe untersucht. Methoden: Von 12 unbehandelten Patienten wurden mittels Filterpapierstreifen während 30 Sekunden Proben von GCF entnommen. Nach der Elution in Buffer wurden die Proben im Western-Immunoblot unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern gegen MMP-8 und MMP-13 untersucht und es erfolgte eine Quantifizierung durch Scanning und Bildanalyse. Die individuellen Intensitäten der Banden wurden als Prozentsatz der gesamten Probenabsorption angegeben und es wurden Patientenmittelwerte errechnet. Von 6 Patienten wurde das Gingivagewebe in Formalin fixiert und in Parafinwachs eingebettet. Mittels eines Avidin-Biotin-Peroxidase-Nachweissystems und unter Verwendung der gleichen Antikörper wurden MMP-8 und MMP-13 lokalisiert. Mit einer kontrastierenden Substratreaktion wurde die Gegenfärbung durchgeführt.

Ergebnisse: Im GCF, das vor Behandlung entnommen wurde ergab sich die Mehrheit der MMP-8-Färbung bei den 80, 75 und 60 kD-Banden, was korrespondiert mit den Prepro-, Pro- und Aktivformen der Enzyme vom PMN-Typ. Die 43 und 38 kD-Banden repräsentierten offensichtlich den aktiven Fibroblastentyp der MMP-8. Die Immunreaktionen bei >100 kD und leqslant R: less-than-or-eq, slant30 kD waren wahrscheinlich Enzym-Inhibitor-Komplexe bzw. degradierte Fragmente. Das MMP-13 wurde hauptsächlich als 60 kD Proenzym und etwas vom 40 kD des aktiven Enzyms sowie einem kleinen Anteil am >100 kD-Komplex beobachtet. Die Prozentsätze der Banden des MMP-8-PMN-Typs des Enzyms und des MMP-13-Proenzyms korrelierten signifkant mit den Gingiva- und Blutungs-Indizes (p<0.05). Die Immunohistochemie des entzündeten gingivalen Bindegewebes zeigte MMP-8 in PMN's, Sulkusepithel und auch Plasmazellen. Die MMP-13-Immunreaktivität wurde im Sulkusepithel und in Makrophagen-ähnlichen Zellen nachgewiesen.

Schlussfolgerung: Bei Patienten mit unbehandelter Parodontitis werden im Sulkusfluid MMP-8 und MMP-13 in aktiven Formen und mit erhöhtem Titer nachgewiesen. Sie haben eher mehrere, als nur eine zelluläre Quelle im erkrankten Parodontium und tragen somit zur Kollagenaseaktivität des Sulkusfluids bei.

Résumé

But: Le but de l'étude a été de déterminer les formes cellulaires et moléculaires de MMP-8 (collagénase-2) et MMP-13 (collagénase-3) associées à la parodontite chronique de l'adulte en examinant les espèces présentes dans le fluide créviculaure gingival (GCF) et la distribution enzymatique dans le tissu gingival.

Méthodes: Des échantillons GCF de 30 s ont été prélevés directement des poches parodontales de 12 patients non-traités en utilisant des bandelettes de papier filtre. Après élution dans un tampon, les échantillons ont été examinés par l'immunoblotting Western avec des anticorps polyclonaux pour MMP-8 et MMP-13 et la quantification par l'analyse d'images par balayage. Les intensités des bandes individuelles ont été exprimées en % de l'absorption totale de l'échantillon et les valeurs moyennes par patient ont été calculées. Le tissu gingival de 6 patients a été fixé dans le formol et enrobé dans la paraffine. MMP-8 et MMP-13 ont été localisés en utilisant les même anticorps et un système de détection de la péroxydase biotine avidine. Une double coloration a été effectuée avec une reaction de substrat de contraste.

Résultats: La majorité de la coloration MMP-8 dans le prétraitement GCF était présente dans les bandes 80, 75 et 60 kD correspondant aux formes prépro-, pro- et actives de l'enzyme type PMN. Les bandes 43 et 38 kD représentaient de manière évidente le MMP-8 type fibroblaste actif. Les réactions immunitaires >100 kD et leqslant R: less-than-or-eq, slant30 kD étaient probablement respectivement des complexes inhibiteurs d'enzymes et des fragments dégradés. MMP-13 a été aperçu essentiellement comme pro-enzyme 60 kD avec quelques enzymes actifs 40 kD et une petite proportion de complexe >100 kD. Les %s de MMP-8 type PMN et MMP-13 pro-enzyme étaient en corrélation significative avec les indices gingivaux et de saignement (p<0.05). L'immunohistochimie et démontré MMP-8 dans les PMNs, l'épithélium du sillon ainsi que dans les plasmocytes du tissu conjonctif gingival enflammé. L'immuno-réactivité MMP-13 était détectée dans l'épithélium du sillon et dans les cellules ressemblant aux macrophages.

Conclusions: De multiples teneurs élevées tant en MMP-8 qu'en MMP-13 de plusieurs plutôt que d'une seule source cellulaire provenant du parodonte malade ont été mises en évidence dans le GCF de la parodontite non-traitée dans des formes actives, et contribuent à l'activité de la collagénase du GCF.

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