SEARCH

SEARCH BY CITATION

Summary

Extracellular proteins were extracted from Phellinus weirii infected Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii var. menziesii) roots and needles to examine endochitinase activity. Chitinases have been associated with the plant's defence response against fungal attack because they hydrolyse chitin, a structural component of fungal cell walls. Protein separation using sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western immunoblot analysis using a polyclonal antibody specific to an endochitinase-like protein (ECP) resulted in the detection of up to three polypeptides between 27 and 30 kDa in size. Two-dimensional gel electrophoresis (2-D PAGE) followed by Western immunoblot analysis revealed that the apoplastic fluid contained multiple ECP isoforms with isoelectric points (pIs) ranging from 5.3 to 5.8 and molecular masses of 27–30 kDa. Chitinase activity in needle and root tissues was measured spectrophotometrically using a colorimetric assay. A gel overlay technique using glycol chitin as a substrate for endochitinase was applied to confirm that the ECP antibody detected an enzymatically active protein. The apoplastic fluid collected from P. weirii-infected winter Douglas-fir needles showed anti-freeze activity and seasonal analysis of needle tissue showed some evidence of ECP accumulation in winter months. ECP was distributed systemically throughout the tree. Increased levels of endochitinase activity in the region of P. weirii infection supports a physiological role for ECP in the plant defence response.

Résumé

Les protéines extra-cellulaires ont été extraites des racines et aiguilles de douglas (Pseudotsuga menziesii var menziesii) infectés par Phellinus weirii (Murr.) Gilbn., pour étudier l'activité endochitinase. Les chitinases ont été associées aux réactions de défense des plantes contre les attaques fongiques parce-qu'elles hydrolysent la chitine, un composant de la paroi des cellules fongiques. La séparation des protéines, réalisée par électrophorèse en gel de polyacrylamide avec sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE), suivie par une analyse par Western immunoblot en utilisant un anticorps polyclonal spécifique d'une protéine de type endochitinase (ECP), a permis la détection de 3 polypeptides de taille comprise entre 27 et 30 kDa. Une électrophorèse sur gel en 2-dimensions (2-D PAGE) suivie par une analyse par Western immunoblot a révélé que le fluide apoplastique contient de multiples isoformes d'ECP avec des pI dans une gamme de 5.3 à 5.8 et des masses moléculaires de 27 à 30 kDa. L'activité chitinase dans les aiguilles et tissus racinaires a été mesurée par spectrophotométrie par une méthode colorimétrique. Une technique d'overlay utilisant de la chitine glycol comme substrat de l'endochitinase a été appliquée pour confirmer que l'anticorps ECP avait détecté une protéine active du point de vue enzymatique. Le fluide apoplastique d'aiguilles récoltées en hiver sur des douglas infectés par P. weirii a montré une activité antigel et l'analyse saisonnière des tissus foliaires a montré une certaine accumulation d'ECP pendant l'hiver. L'ECP est répartie de façon systémique dans l'ensemble de l'arbre. Les niveaux accrus d'activité endochitinase dans la zone infectée par P. weirii suggère un rôle physiologique de l'ECP dans les réactions de défense de la plante.

Zusammenfassung

Aus Wurzeln und Nadeln von mit Phellinus weirii infizierten Douglasien (Pseudotsuga menziesii var. menziesii) wurden extrazelluläre Proteine extrahiert, um die Endochitinase-Aktivität zu bestimmen. Chitinasen werden mit der pflanzlichen Abwehrreaktion auf Pilzinfektionen in Verbindung gebracht, da sie Chitin, eine Strukturkomponente der pilzlichen Zellwand, hydrolysieren. Die Proteine wurden mit Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt, gefolgt von einer Western Immunoblot-Analyse mit einem gegen ein Endochitinase-ähnliches Protein (ECP) spezifischen polyklonalen Antikörper. Hiermit liessen sich bis zu drei Polypeptide zwischen 27-30 kDa nachweisen. Eine zweidimensionale Gelelektrophorese (2-D PAGE) mit anschliessender Western Immunoblot-Analyse ergab, dass die Apoplastenflüssigkeit multiple ECP-Isoformen enthielt (mit pIs von 5,3 bis 5,8 und Molekularmassen von 27 bis 30 kDa). Die Chitinase-Aktivität wurde auch im Nadel- und Wurzelgewebe spektrophotometrisch mit einer Farbreaktion gemessen. Um sicher zu stellen, dass der ECP-Antikörper ein enzymatisch aktives Protein nachwies, wurde eine Gel-Overlay-Methode verwendet, mit Glycolchitin als Substrat für die Endochitinase. Die Apoplastenflüssigkeit der Nadeln von mit P. weirii infizierten Douglasien zeigte in Winterzustand eine Antifrost-Aktivität, ihre Analyse während des gesamten Jahres ergab aber keine Hinweise auf eine ECP-Anreicherung während der Wintermonate. ECP war systemisch im gesamten Baum enthalten. Die erhöhte Endochitinase-Aktivität in Bereichen mit P. weirii-Infektion lässt auf eine physiologische Rolle von ECP in der Pflanzenabwehr schliessen.