Identification of Old World Leishmania species by PCR–RFLP of the 7 spliced leader RNA gene and reverse dot blot assay

Authors

  • Kifaya Azmi,

    1.  Al-Quds Nutrition and Health Research Institute, Faculty of Medicine, Al-Quds University, Abu-Deis, West Bank, Palestine
    2.  Institute of Microbiology and Hygiene, Charité University Medicine Berlin, Dorotheenstr. 96, Berlin, Germany
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  • Abedelmajeed Nasereddin,

    1.  Al-Quds Nutrition and Health Research Institute, Faculty of Medicine, Al-Quds University, Abu-Deis, West Bank, Palestine
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  • Suheir Ereqat,

    1.  Al-Quds Nutrition and Health Research Institute, Faculty of Medicine, Al-Quds University, Abu-Deis, West Bank, Palestine
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  • Gabriele Schönian,

    1.  Institute of Microbiology and Hygiene, Charité University Medicine Berlin, Dorotheenstr. 96, Berlin, Germany
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  • Ziad Abdeen

    1.  Al-Quds Nutrition and Health Research Institute, Faculty of Medicine, Al-Quds University, Abu-Deis, West Bank, Palestine
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Corresponding Author Kifaya Azmi, Al-Quds University, Al-Quds Nutrition and Health Research Institute, Faculty of Medicine, Al-Quds University, Abu-Deis, P.O. Box: 20760, West Bank, Palestine. Tel.: +972 26 289849; Fax: +972 26 289798; E-mail: Kifaya_alkam@yahoo.com

Summary

The aim of the study was to assess the 7SL RNA PCR followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) and reverse dot blot (RDB) assays for use in identification of Old World Leishmania species. Species-specific RFLP patterns were obtained for Leishmania major, Leishmania tropica and the Leishmania donovani complex when the 7SL RNA PCR product was digested with the restriction enzyme BsuRI, an isoschizomer of HaeIII. For the RDB assay, biotin-labelled 7SL RNA amplicons were hybridized to Leishmania genus-specific and species-specific oligonucleotide probes immobilized onto a membrane. The Old World Leishmania species could be distinguished by using five probes: one that was a genus-specific probe and hybridized to all Leishmania species (Lc), two that were specific for L. major (Lm1 and Lm2), one that was specific for L. tropica (Lt) and one that detected both L. major and L. tropica (Lmt). The PCR–RDB was 10 times more sensitive than 7SL PCR and can detect <1 parasite. In addition, the identification of species was easier and more reliable than with 7SL PCR–RFLP. 7SL PCR–RFLP detected parasites in 50 of 57 clinical samples, whereas PCR–RDB detected 53 and 55 were detected by amplification of kinetoplast (k) DNA. The 7SL RNA PCR has proven useful for direct diagnosis of Old World leishmaniasis, especially when combined with the RBD assay for species identification.

Abstract

Identification des espèces de Leishmania du Vieux Monde par PCR-RFLP du gène de l’ARN 7 leader épissé et par Dot Blot inversé

Le but de cette étude était d’évaluer des tests de PCR de l’ARN 7SL suivie du polymorphisme de la taille des fragments de restriction (RFLP) et du Dot Blot inversé (RDB) dans l’identification des espèces de Leishmania du Vieux Monde. Des profils RFLP spécifiques aux espèces ont été obtenus pour L. majeurs, L. tropica et L. donovani complex lorsque le produit PCR de l’ARN 7SL est digéré par l’enzyme de restriction BsuRI, un isoschizomer de HaeIII. Pour le test RDB, des amplicons d’ARN 7SL marqués à la biotine ont été hybridés avec des sondes oligonucléotidiques spécifiques du genre et d’espèces Leishmania, immobilisées sur une membrane. Les espèces Leishmania du Vieux Monde pouvaient être distinguées sur base de cinq sondes: une sonde spécifique du genre et hybridant avec toutes les espèces de Leishmania (Lc), deux sondes spécifiques àL. major (Lm1 et Lm2), une spécifique àL. Tropica (Lt) et une détectant à la fois L. major et L. Tropica (Lmt). La PCR-RDB était 10 fois plus sensible que la PCR du 7SL et pouvait détecter <1 parasite. En outre, l’identification des espèces était plus facile et plus fiable qu’avec la PCR-RFLP du 7SL. La PCR-RFLP du 7SL a détecté des parasites dans 50 des 57 échantillons cliniques, alors que la PCR-RDB en a détecté 53 et 55 ont été détectés par l’amplification de kinétoplaste (k) de l’ADN. La PCR de l’ARN 7SL s’est avérée utile pour le diagnostic direct de leishmaniose de l’Ancien Monde, surtout lorsqu’elle est combinée avec le test RBD pour l’identification des espèces.

Abstract

Identificación de una especie de Leishmania del Viejo Mundo mediante PCR- RFLP del gen 7SL y dot blot reverso

El objetivo del estudio era evaluar la PCR para el gen ARN 7SL seguida de las pruebas de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y Dot Blot Reverso (DBR), con el fin de utilizarlo para la identificación de especies de Leishmania del Viejo Mundo. Se obtuvieron patrones de RFLP especie-específicos para L. major, L. tropica y el complejo L. donovani cuando el producto de la PCR del ARN 7SL era digerido con la enzima de restricción BsuRI, un isoesquizómero de HaeIII. Para el ensayo RDB, los amplicones biotinizados de ARN 7SL fueron hibridados con sondas de oligonucleótidos género-específicas y especie-específicas de Leishmania immobilizadas en una membrana. Las especies de Leishmania del Viejo Mundo se podían distinguir utilizando 5 sondas: una específica para el género, que hibridaba con todas las especies de Leishmania (Lc), dos específicas para L. major (Lm1 y Lm2), una específica para L. tropica (Lt) y una que detectaba tanto L. major como L. tropica (Lmt). La PCR-DBR era 10 veces más sensible que la PCR 7SL y podía detectar <1 parásito. Adicionalmente, la identificación de especies era más fácil y más confiable que con la PCR-RFLP para 7SL. La PCR-RFLP para 7SL detectó parásitos en 50 de las 57 muestras clínicas, mientras que la PCR-DBR detectaba 53 y se detectaron 55 mediante amplificación del ADN de cinetoplasto detectado. Se mostró que la PCR de ARN 7SL era útil para el diagnóstico directo de la leishmaniasis del Viejo mundo, especialmente cuando se combinaba con un DBR para identificar la especie.

Ancillary