Development and evaluation of a single-step multiplex PCR to differentiate the aquatic stages of morphologically similar Aedes (subgenus: Stegomyia) species

Authors


Rupenangshu K. Hazra, Medical Entomology Department, Regional Medical Research Centre, Bhubaneswar 751023, India. Tel.: +91 674 2301416; Fax: +91 674 2301351; E-mail: rupenkh@yahoo.co.in

Summary

Objective  To develop a single-step multiplex PCR to differentiate the aquatic stages of Aedes aegypti, Aedes albopictus and Aedes vittatus collected from different breeding spots in arbovirus endemic/epidemic areas and to detect the most abundant species by the multiplex PCR.

Methods  Aquatic stages of different mosquito species were sampled by inspecting artificial and natural breeding sites in domestic and peridomestic areas. DNA was isolated from different stages of the three Aedes species. Using novel primers based on 18S rDNA sequence, a single-step multiplex PCR was developed to clearly distinguish the three Aedes species. It was then evaluated in the aquatic stages of Aedes species collected from different areas.

Results  A total of 1150 aquatic stages were collected from 294 breeding spots, of which 156 contained Aedes species. Discarded tires were the major breeding spots of Aedes species. The aquatic stages were clustered into 230 pools; Ae. albopictus was detected in the largest number of pools, followed by Ae. aegypti and Ae. vittatus.

Conclusions  The Multiplex PCR clearly differentiated the aquatic stages of the three Aedes species and detected that Ae. albopictus was most profuse in different breeding spots surveyed, hence indicating to be the main vector in this region. So control measures can be designed against Ae. albopictus at an early stage to prevent any arboviral outbreak. This method is a convenient tool for precise identification of Aedes vectors during entomological surveys in arbovirus endemic/epidemic areas where several species coexist.

Abstract

Objectif:  Développer une PCR multiplex àétape unique pour différencier les stades aquatiques des espèces Aedes aegypti, Aedes albopictus et Aedes vittatus, collectés dans différents endroits de reproduction dans des zones endémiques/épidémiques pour arbovirus et détecter les espèces les plus abondantes par PCR multiplex.

Méthodes:  Les stades aquatiques de différentes espèces de moustiques ont étééchantillonnés en inspectant les sites de reproduction artificiels et naturels dans les zones domestiques et péri domestiques. L’ADN a été isolé des différents stades des trois espèces d’Aedes. En utilisant des amorces basées sur la séquence d’ADNr 18S, une PCR multiplex àétape unique a été développée pour distinguer clairement les trois espèces du genre Aedes. Elle a ensuite étéévaluée sur les stades aquatiques des espèces d’Aedes recueillies dans différents endroits.

Résultats:  1150 stades aquatiques ont été recueillis dans 294 endroits de reproduction dont 156 contenaient des espèces Aedes. Les pneus usagés étaient les principaux points de reproduction des espèces du genre Aedes. Les stades aquatiques ont été regroupés en 230 pools. Ae. albopictus a été détecté dans le plus grand nombre de pools, suivie par Ae. aegypti et Ae. vittatus.

Conclusions:  La PCR multiplex différencie clairement les stades aquatiques des trois espèces Aedes et a trouvé qu’Ae. albopictusétait la plus abondante dans les différentes zones de reproduction sondées étant par conséquent, le principal vecteur dans cette région. Ainsi, les mesures de contrôle pourraient être conçues contre Ae. albopictusà un stade précoce afin de prévenir toute épidémie à arbovirus. Cette méthode est un outil pratique pour l’identification précise des vecteurs Aedes lors des enquêtes entomologiques dans des zones endémiques/épidémiques pour arbovirus où plusieurs espèces cohabitent.

Abstract

Objetivo:  Desarrollar una PCR multiplex realizada en un solo paso para diferenciar estadios acuáticos de Aedes aegypti, Aedes albopictus y Aedes vittatus recolectados de diferentes focos de reproducción en áreas endémicas / epidémicas para arbovirus y detectar las especies más abundantes mediante PCR multiplex.

Métodos:  Los estadíos acuáticos de diferentes especies de mosquito se muestrearon inspeccionando focos de reproducción artificiales y naturales en áreas domésticas y peridomésticas. Se aisló el ADN de diferentes estadíos de las tres especies de Aedes. Utilizando cebadores basados en la secuencia del ADNr 18S, se desarrolló una PCR multiplex de un solo paso para distinguir claramente entre las tres especies de Aedes. Después se evaluó en los estadíos acuáticos de especies de Aedes recolectados de diferentes áreas.

Resultados:  Se recolectaron 1150 estadíos acuáticos de 294 focos de reproducción, de los cuales 156 contenían la especie Aedes. Las ruedas abandonadas eran los principales focos de reproducción de la especie Aedes. Los estadíos acuáticos estaban agrupados en 230 charcos; Ae. albopictus fue la especie detectada en un mayor número de charcos, seguido por Ae. aegypti y Ae. vittatus.

Conclusiones:  La PCR multiplex diferencia claramente los estadíos acuáticos de las tres especies de Aedes. Se detectó que Ae. albopictus era la especie más abundante en los diferentes focos de reproducción estudiados, indicando que se trata del principal vector en esta región. Por lo tanto, podrían diseñarse medidas de control frente a Ae. albopictus en un estadío temprano para prevenir un brote de arbovirus. Este método es una herramienta convencional para la identificación precisa de vectores de Aedes durante estudios entomológicos en áreas endémicas / epidémicas para arbovirus en donde coexisten varias especies.

Ancillary