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Abstract

β-Defensins (BDs) are highly conserved antimicrobial peptides important in innate defence against bacteria. β-Defensin 3 has a specific role in protecting the skin. This study quantified the minimal inhibitory concentration (MIC) of human (h)BD3 against Staphylococcus pseudintermedius isolates from atopic and healthy dogs. Single colony isolates (1 × 105 colony-forming units/mL log phase) were cultured with doubling dilutions of hBD3 in sodium phosphate buffer from 0.8 to 50 μg/mL at 37 °C for 2 h, before adding 100 μL of tryptone soy broth and incubating for a further 20 h. Bacterial growth was assessed as the mean optical density at 540 nm corrected for background. The median MIC was 12.5 μg hBD3/mL (range 3.125–25 μg/mL; n = 22). Forty-five percent of the isolates were inhibited at ≤6.25 μg hBD3/mL, and 90% were inhibited at ≤12.5 μg hBD3/mL. Bacterial growth was not inhibited at ≤1.6 μg hBD3/mL. There were no significant differences in the inhibition by hBD3 of isolates from atopic (median MIC 12.5 μg/mL, range 6.25–25 μg/mL, n = 14) and healthy dogs (median MIC 9.4 μg/mL, range 3.125–12.5 μg/mL, n = 8); from noninfected colonized sites (median MIC 12.5 μg/mL, range 3.125–25 μg/mL, n = 16) and infected lesions (median MIC 9.4 μg/mL, range 6.25–12.5 μg/mL, n = 6); or between sample sites (nose median MIC 12.5 μg/mL, range 6.25–25 μg/mL, n = 5; perineum median MIC 12.5 μg/mL, range 3.125–25 μg/mL, n = 7; ear median MIC 6.25 μg/mL, range 6.25–12.5 μg/mL, n = 4; lesions median MIC 9.4 μg/mL, range 6.25–12.5 μg/mL, n = 6). In conclusion, hBD3 inhibited the growth of canine S. pseudintermedius isolates in vitro irrespective of origin.

Résumé

Les défensines β (BDs) sont hautement conservés et sont d’importants peptides antimicrobiens de la défense innée contre les bactéries. BD3 a un rôle spécifique dans la protection de la peau. Cette étude quantifie la concentration minimale inhibitrice (CMI) de la (h)BD3 humaine contre les isolats de Staphylococcus pseudintermedius de chiens atopiques et sains. Des isolats de colonie unique (1 × 105 CFU/mL log phase) ont été mis en culture avec des dilutions doublées d’hBD3 et un tampon de phosphate de sodium de 0.8–50 μg/mL à 37 °C pendant deux heures, avant d’ajouter 100 μL de bouillon de soja tryptique et d’incuber pendant 20 heures. La croissance bactérienne a étéévaluée par densité moyenne optique et bruits de fond corrigés à 540 nm. La CMI moyenne était de 12.5 μg hBD3/mL (amplitude de 3.125–25 μg/mL; n = 22). Quarante cinq pourcent des souches étaient inhibées à ≤ 6.25 μg hBD3/mL, et 90%étaient inhibées à ≤ 12.5 μg hBD3/mL. La croissance bactérienne n’était plus inhibée à ≤ 1.6 μg hBD3/mL. Il n’y avait aucune différence significative d’inhibition par hBD3 des isolats issus des atopiques (CMI moyenne 12.5 μg/mL; amplitude 6.25–25; n = 14) et des chiens sains (CMI moyenne 9.4 μg/mL; amplitude 3.125–12.5; n = 8); entre des sites colonisées non-infectés (CMI moyenne 12.5 μg/mL; amplitude 3.125–25 μg/mL; n = 16) et lésions infectées (CMI moyenne 9.4 μg/mL; amplitude 6.25–12.5 μg/mL; n = 6) ; ou entre les sites d’échantillonnage (nez, CMI moyenne 12.5 μg/mL, amplitude 6.25–25 μg/mL; n = 5; périnée : CMI moyenne 12.5 μg/mL, amplitude 3.125–25 μg/mL, n = 7; oreille : CMI moyenne 6.25 μg/mL, amplitude 6.25–12.5 μg/mL, n = 4; lésions : CMI moyenne 9.4 μg/mL, amplitude 6.25–12.5 μg/mL, n = 6). En conclusion, l’hBD3 inhibe, in vitro, la croissance bactérienne des souches canines de S. pseudintermedius quelque soit leur origine.

Resumen

Las defensinas β (BDs) son péptidos antimicrobianos altamente conservados de importancia en el sistema de defensa innato frente a bacterias. BD3 tiene un papel especifico en la protección de la piel. Este estudio cuantifica la concentración inhibitoria mínima (MIC) de BD3 humana frente a aislados de Staphylococcus pseudintermedius en perros atópicos y sanos. Aislados de una colonia simple (1 × 105 CFU/mL en fase logarítmica) fueron cultivados con diluciones dobles de hBD3 en tampón de fosfato sódico desde 0,8–50 μg/mL a 37˚ C durante dos horas, antes de añadir 100 μl de caldo de triptona de soja y de incubar durante otras 20 horas. Se evalúo el crecimiento bacteriano mediante la densidad óptica a 540 nm corregida para el fondo. La mediana MIC fue 12,5 μg hBD3/mL (rango 3,125–25 μg/mL; n = 22). Cuarenta y cinco por ciento de los aislados fueron inhibidos a ≤ 6.25 μg hBD3/mL, y 90% fueron inhibidos a ≤ 12.5 μg hBD3/mL. El crecimiento bacteriano no se inhibió a ≤ 1.6 μg hBD3/mL. No hubo diferencias significativas en la inhibición por hBD3 de aislados de perros atópicos (mediana MIC 12, 5 μg/mL, rango 6,25–25; n = 14) y perros sanos (mediana MIC 9,4 μg/mL; rango 3,125–12,5; n = 8); de sitios colonizados no infectados (mediana MIC 12,5 μg/mL; rang0 3,125–25 μg/mL; n = 16) y lesiones infectadas (mediana MIC 9,4 μg/mL; 6,25–12,5 μg/mL; n = 6); o entre sitios muestreados (nariz mediana MIC 12,5 μg/mL, rango 6,25–25 μg/mL; n = 5; perineo mediana MIC 12,5 μg/mL, rango 3,125–25 μg/mL, n = 7; oído mediana MIC 6,25 μg/mL, rango 6,25–12,5 μg/mL, n = 4; lesiones mediana MIC 9,4 μg/mL, rango 6,25–12,5 μg/mL, n = 6). En conclusión, hBD3 inhibió el crecimiento de aislados de S. pseudintermedius canino in vitro independientemente del origen.

Zusammenfassung

β-Defensine (BDs) sind hochkonservierte antimikrobielle Peptide, die bei der angeborenen Abwehr von Bakterien wichtig sind. BD3 spielt eine besondere Rolle beim Schutz der Haut. In dieser Studie wurde die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) des humanen (h)BD3 gegen Staphylokokkus pseudointermedius Isolate von atopischen und gesunden Hunden quantifiziert. Isolate von einzelnen Kolonien (1 × 105 CFU/mL log phase) wurden mit hBD3 in Natriumphosphatbuffer in doppelten Verdünnungen von 0,8–50 μg/mL bei 37 °C für zwei Stunden kultiviert, bevor 100 μL Trypton Sojabrühe zugegeben und für weitere 20 Stunden inkubiert wurde. Das bakterielle Wachstum wurde mittels der durchschnittlichen optischen Dichte bei 540 nm, die gegenüber dem Hintergrund korrigiert war, beurteilt. Der Medianwert der MIC betrug 12,5 μg hBD3/mL (Bereich von 3,125 bis 25 μg/mL; n = 22). Fünfundvierzig Prozent der Isolate wurden bei ≤6,25 μg hBD3/mL und 90% bei ≤12,5 μg hBD3/mL inhibiert. Bei ≤1,6 μg hBD3/mL wurde das bakterielle Wachstum nicht inhibiert. Es bestanden keine signifikanten Unterschiede bei der Inhibition durch hBD3 zwischen den Isolaten von atopischen (Medianwert der MIC 12,5 μg/mL; Bereich von 6,25 bis 25; n = 14) und gesunden Hunden (Medianwert der MIC 9,4 μg/mL; Bereich von 3,125 bis 12,5; n = 8); von nicht-infizierten kolonisierten Stellen (Medianwert der MIC 12,5 μg/mL; Bereich von 3,125 bis 25 μg/mL; n = 16) und infizierten Läsionen (Medianwert der MIC 9,4 μg/mL; 6,25–12,5 μg/mL; n = 6); oder zwischen den verschiedenen Stellen der Probenahme (Nase Medianwert der MIC 12,5 μg/mL, Bereich von 6,25 bis 25 μg/mL; n = 5; Perineum Medianwert der MIC 12,5 μg/mL, Bereich von 3,125–25 μg/mL; n = 7; Ohr Medianwert der MIC 6,25 μg/mL, Bereich von 6,25 bis 12,5 μg/mL, n = 4; Läsionen Medianwert der MIC 9,4 μg/mL, Bereich von 6,25 bis 12,5 μg/mL, n = 6). Zusammenfassend kann man sagen, dass hBD3 das Wachstum von S. pseudointermedius Isolaten in vitro unabhängig von ihrer Herkunft inhibierte.

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