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Abstract

Antimicrobial peptides (AMPs) are small proteins involved in defense against pathogenic organisms. Defensins and cathelicidin are the most frequently studied human AMPs. Our goals were to determine the distribution of AMPs and evaluate their mRNA expression in normal canine skin. Skin biopsies were taken from six healthy beagles. The relative transcript level of canine cathelicidin (cCath) and β-defensin (cBD)-1, cBD2 and cBD3 mRNA was quantified using quantitative real-time polymerase chain reaction. Indirect immunofluorescence (IIF), using polyclonal antibodies against cBD2, cBD3 and cCath, was used to evaluate protein localization in the skin of healthy dogs. The Pfaffl method, using experimentally determined primer efficiencies of amplification, was used to determine the expression level of cCath, cBD1 and cDB3 relative to cDB2. The levels of cCath, cBD3 and cBD1 mRNA were 358, 296 and 177 times higher than those of cBD2, respectively. Using IIF, cBD2 and cBD3 protein fluorescence was detected in all layers of the epidermis, whereas cCath was detected predominantly in the stratum granulosum and corneum. In addition, antimicrobial peptide detection was limited to the infundibular portion of the pilosebaceous units. We have validated useful methods to evaluate AMPs in canine skin. Further studies are needed to compare AMP expression in healthy dogs with that of dogs with inflammatory skin conditions.

Résumé

Les peptides antimicrobiens (AMPs) sont de petites protéines impliquées dans la défense contre les organismes pathogènes. Les défensines et la cathelicidine sont les AMPs humains les plus fréquemment étudiés. Nos objectifs étaient de déterminer la distribution des AMPs et d’évaluer l’expression de leur ARNm dans la peau canine normale. Des biopsies cutanées ont été réalisées sur six beagles sains. Le niveau relatif de transcription des ARNm de la cathelicidine canine (cCath) et des béta-défensines (cBD)-1, -2 et -3 a été mesuré par PCR quantitative temps-dépendante (RT-PCR). L’immunofluorescence indirecte (IIF) utilisant les anticorps polyclonaux contre cBD2, cBD3 et cCath, a permis de localiser les protéines dans la peau de chiens sains. La méthode expérimentale Pfaffl de détermination de l’efficacité de l’amplification des primers a été utilisée pour obtenir le niveau d’expression de cCath, cBD1 et cBD3 relatif à cBD2. Les niveaux d’ARNm de cCath, cBD3 et cBD1 étaient respectivement 358, 296 et 177 fois plus élevés que ceux de cBD2. L’immunofluorescence des protéines cBD2 et cBD3 a été détecté dans toutes les couches de l’épiderme, tandis que cCath a été détecté principalement dans le stratum granulosum et le stratum corneum. De plus, la détection des peptides antimicrobiens était limitée à la portion infundibulaire des unités pilosébacées. Nous avons validé des méthodes utiles d’évaluation des AMPs dans la peau canine. Des études supplémentaires comparant l’expression d’AMP des chiens sains et des chiens atteints de dermatoses inflammatoires sont nécessaires.

Resumen

Los péptidos antimicrobianos (AMPs) son proteínas de pequeño tamaño implicadas en la defensa contra agentes patógenos. Las defensinas y catelicidinas son las AMPs estudiadas con más frecuencia en humanos. Nuestros objetivos fueron determinar la distribución de AMPs y evaluar su expresión de mRNA en piel normal de perros. Se tomaron biopsias de piel de seis perros Beagle sanos. El nivel relativo de transcripción de mRNA de catelicidina (cCath) y beta-defensinas (cBD)-1, -2 y -3 se cuantificó utilizando PCR cuantitativa a tiempo real (RT-PCR). Se utilizó inmnofluorescencia indirecta (IIF) con anticuerpos policlonales frente a cBD2, cBD3 y cCath para evaluar la localización de las proteínas en la piel de perros sanos. Se usó el método Pfaffl, utilizando eficiencias de amplificacion de los iniciadores determinadas de forma experimental, para calcular el nivel de expresión de cCath, cBD1 y cBD3 relativo a cBD2. Los niveles de mRNA de cCath, cBD3 y cBD1 fueron 358, 296 y 177 veces mayores que los niveles de cBD2, respectivamente. Utilizando IIF, la fluorescencia proteica de cBD2 and cBD3 se detectó en todos los estratos de la epidermis, mientras que cCath se detectó predominantemente en los estratos granuloso y corneo. Ademas, la detección de péptidos antimicrobianos se limitó a la porción infundibular de las unidades pilosebaceas. Hemos validado métodos útiles para evaluar la expresión de AMPs en la piel canina. Se necesitan estudios mas detallados comparando la expresión de AMPs en perros sanos con perros que presentan procesos inflamatorios de la piel.

Zusammenfassung

Antimikrobielle Peptide (AMPs) sind kleine Proteine, die an der Abwehr pathogener Organismen beteiligt sind. Defensine und Cathelicidin sind die am häufigsten untersuchten AMPs des Menschen. Unsere Ziele waren es, die Verteilung der AMPs festzustellen und ihre mRNA Expression in normaler Hundehaut zu untersuchen. Es wurden Hautbiopsien von sechs gesunden Beagles genommen. Das relative Transkriptionslevel von caninem Cathelicidin (cCath) und Beta-Defensinen (cBD)-1, -2 und -3 mRNA wurde mittels quantitativer Real-Time PCR (RT-PCR) quantitativ erfasst. Indirekte Immunfluoreszenz (IIF) mit polyklonalen Antikörpern gegen cBD2 und cBD3 und cCath wurde verwendet, um die Lokalisation der Proteine in der Haut gesunder Hunde zu untersuchen. Es wurde die Pfaffl Methode, die eine experimentell determinierte Effektivität von Primern im Bezug auf die Amplifizierung verwendet, angewandt, um das Expressionslevel von cCath, cBD1 und cBD3 im Vergleich zu cBD2 zu bestimmen. Die Expressionslevel von cCath, cBD3 und cBD1 mRNA waren 358, 296 beziehungsweise 177 Mal höher als die von cBD2. Mittels IIF wurde die Protein Fluoreszenz von cBD2 und cBD3 in allen Schichten der Epidermis gefunden, während cCath vorwiegend im Stratum granulosum uund corneum gefunden wurde. Zusätzlich war die Bestimmung von antimikrobiellen Peptiden auf den Abschnitt des Infundibulums der pilosebaziösen Einheit beschränkt. Wir haben sinnvolle Methoden validiert, um die AMPs der Hundehaut zu bestimmen. Weitere Studien sind nötig, um die AMP Expression bei gesunden Hunden mit jener der Hunde mit entzündlichen Hauterkrankungen zu vergleichen.

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