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Abstract

The dermal papilla (DP) plays pivotal roles in hair follicle morphogenesis and cycling. However, our understanding of the biology of the canine DP is extremely limited. The aim of this study was to elucidate molecular biological and immunohistochemical characteristics of canine DP cells and determine appropriate conditions for in vitro expansion. Histological investigation revealed that the canine DP expressed biomarkers of human and rodent DP, including alkaline phosphatase (ALP) and versican. When microdissected, canine DP, but not fibroblasts, strongly expressed the DP-related genes for alkaline phosphatase, Wnt inhibitory factor 1 and lymphoid enhancer-binding factor 1, confirming successful isolation. The growth rate of isolated canine DP cells was moderate in conventional culture conditions for rodent and human DP; however, AmnioMAX-C100 complete medium allowed more efficient cultivation. Dermal papilla marker gene expression was maintained in early passage cultured DP cells, but gradually lost after the third passage. Approaches to mimic the in vivo DP environment in culture, such as supplementation of keratinocyte-conditioned medium or use of extracellular matrix-coated dishes, moderately ameliorated loss of DP gene expression in canine DP cells. It is possible that constituent factors in AmnioMAX may influence culture. These findings suggested that further refinements of culture conditions may enable DP cell expansion without impairing intrinsic properties and, importantly, demonstrated that AmnioMAX-cultured early passage canine DP cells partly maintained the biological characteristics of in vivo canine DP cells. This study provides crucial information necessary for further optimization of culture conditions of canine DP.

Résumé

La papille dermique (DP) joue un rôle essentiel dans la morphogénèse et le cycle du follicule pileux. Toutefois, notre compréhension de la biologie de la DP canine est extrêmement limitée. L’objectif de cette étude était de déterminer les caractéristiques des cellules de DP canine ainsi que les conditions appropriées pour leur expansion in vitro. L’analyse histologique a révélé que la DP canine exprimait les biomarqueurs de DP humaine et de rongeurs, regroupant la phosphatase alcaline (ALP) et Versican. Après dissection, la DP canine mais pas les fibroblastes, exprimait fortement les gènes liés à l’ALP de DP, WIF1(Wnt inhibitory factor 1) et LEF1 (Lymphoid enhancer-binding factor 1), confirmant le succès de l’isolement. Le taux de croissance des cellules de DP canine isolées était modéré sous des conditions de culture conventionnelle pour DP d’humains et de rongeurs. Cependant le milieu complet AmnioMAX-C100 a permis une culture plus efficace. L’expression du gène marqueur était maintenue dans les premiers passages de cultures de cellules de DP mais était progressivement perdue après le troisième passage. Les essais pour mimer l’environnement in vivo de DP en culture, comme la suplémentation avec milieu de culture conditionnés pour kératinocytes ou l’utilisation de plaques revêtues de matrices extracellulaires, ont permis une amélioration modérée de la perte de l’expression de gène de DP par les cellules canines de DP. Il est possible que les facteurs constituants de AmnioMAX influencent la culture. Ces résultats suggèrent que des affinements supplémentaires des conditions de culture pourraient permettre l’expansion des cellules de DP sans compromettre leurs propriétés intrinsèques et surtout, que les premiers passages de culture de cellules de DP canines sur AmnioMAX conservaient partiellement les caractéristiques biologiques des cellules de DP canines in vivo. Cette étude fourni une information cruciale nécessaire pour l’optimisation des conditions de futures cultures de DP canines.

Resumen

La papilla dérmica (DP) juega un papel esencial en la morfogénesis y el ciclo del folículo piloso. Sin embargo, nuestro entendimiento de la biología del la DP canina es muy limitado. El propósito de este estudio fue elucidar las características moleculares, biológicas e inmunohistoquímicas de las células de la DP y determinar la condiciones mas apropiadas para la expansión in vitro. La investigación histológica reveló que la DP canina expresaba biomarcadores de la DP de humanos y de ratones, incluida la fosfatasa alcalina (ALP) y el versicán. Cuando se utilizó microdisección, las células de la DP canina, pero no los fibroblastos, expresaron intensamente genes relacionadas con la DP como ALP, factor de inhibición Wnt-1 (WIF-1) y el factor de estimulación de unión linfoide-1 (LEF-1), confirmando un aislamiento exitoso. El ritmo de crecimiento de las células aisladas de la DP canina fue moderado bajo condiciones convencionales de cultivo para células de la DP de ratones y de humanos, sin embargo, medio completo AmnioMAX-C100 permitió un cultivo mas eficiente. Se mantuvo la expresión de los marcadores de la DP en las células de los pases tempranos en cultivo, pero gradualmente se perdieron tras el tercer pase. Intentos de reproducir la condiciones del microambiente de la DP in vivo en cultivo, tal como el suplemento con medio condicionado para queratinocitos o el uso de placas cubiertas con matriz extracellular, ligeramente mejoraron la perdida de los genes de la DP en la células. Es posible que factores constitutivos del medio AmnioMAX influyan el cultivo. Estos hallazgos sugieren que es necesario mejorar las condiciones de cultivo para permitir la expansión de las células de la DP sin alterar las propiedades intrínsecas, y, lo que es mas importante, demostró que pases iniciales de células DP en cultivo con medo AmnioMAX mantenían parcialmente las características de las células de la DP in vivo. Este estudio aporta información crucial necesaria para posterior optimización del las condiciones de cultivo de células de la DP canina.

Zusammenfassung

Die dermale Papille (DP) spielt eine entscheidende Rolle bei der Morphogenese des Haarfollikels und des Haarzyklus. Nichtsdestotrotz ist unsere Kenntnis der Biologie der caninen DP stark limitiert. Es war das Ziel dieser Studie, die molekularbiologischen und immunhistochemischen Merkmale der caninen DP Zellen zu beleuchten und geeignete Bedingungen für ihre Entwicklung in vitro zu bestimmen. Die histologische Untersuchung zeigte die Expression von Biomarkern der Papilla des Menschen und der Nager, ebenso der alkalischen Phosphatase (ALP) und von Versican. Nach der Mikrodissektion bestand eine starke Expression der caninen DP (nicht aber der Fibroblasten) von DP-verwandten Genen ALP, Wnt Inhibitory Factor 1 (WIF1) und Lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF1), was eine erfolgreiche Isolierung bestätigte. Die Wachstumsrate von isolierten caninen DP-Zellen war bei konventionellen Kulturbedingungen für die DP des Menschen und der Nager mäßig, AmnioMAX-C100 Komplettmedium erlaubte jedoch eine effizientere Kultivierung. Die Expression von DP Markergenen war in DP-Zellen der Frühkultur erhalten, ging aber nach der dritten Passage graduell verloren. Methoden, die Umgebung von DP in vivo in der Kultur nachzuahmen, wie etwa die Supplementierung von Keratinozyten-konditioniertem Medium oder der Verwendung von extrazellulären mit Matrix ausgekleideten Gefäßen, verringerte den Verlust der DP Genexpression in den caninen DP Zellen nur mäßig. Es besteht die Möglichkeit, dass Bestandteile von AmnioMAX die Kultur beeinflussen könnten. Diese Ergebnisse geben Hinweise darauf, dass eine weitere Vervollkommnung der Kulturbedingungen das Wachstum von DP Zellen ermöglichen könnte ohne ihre intrinsischen Eigenschaften zu beeinträchtigen und es wurde etwas sehr Wesentliches gezeigt, nämlich dass caninen DP Zellen einer Frühkultur in AmnioMAX teilweise die biologischen Charakteristika der caninen DP Zellen in vivo erhalten geblieben sind. Diese Studie liefert wichtige Informationen, die für eine zukünftige Optimisierung der Kulturbedingungen für canine DP Zellen essentiell sind.

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