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Abstract

Meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) causes serious skin and soft-tissue infections of humans and animals. Multiple strains of MRSA have been characterized, and one in particular, designated as strain USA 500, causes infections predominantly of horses and the people who work with them. The purpose of this study was to optimize an assay which could subsequently be used to compare the relative avidity of different S. aureus strains for equine corneocytes. Corneocytes were collected from the perineal skin of 10 healthy horses onto adhesive discs. The discs were then incubated at 37 °C with an S. aureus field strain at each of three concentrations [107, 108 and 109 colony forming units (CFU)/mL] and for each of three incubation periods (45, 90 and 180 min). After standardized rinsing and staining procedures, discs were examined at ×1,000 magnification and areas containing confluent corneocytes photographed. The percentage of surface area occupied by adherent bacteria was analysed using image processing and analysis software. Significant colour space image processing was required to distinguish bacteria from the ubiquitous melanin granules present within equine corneocytes. Objective and subjective methods were used to determine optimal conditions for specific adherence without introducing confounding factors. A bacterial concentration of 108 CFU/mL incubated with corneocytes for 45 min produced maximal bacterial adhesion with the least amount of interbacterial clumping. Future studies should utilize these conditions for optimal assay performance.

Résumé

Les Staphylococcus aureus résistants à la méthicilline (MRSA) sont responsables d’infections sévères de la peau et des tissus mous chez l’homme comme chez l’animal. De nombreuses souches de MRSA ont été identifiées et, une en particulier – nommée souche USA 500- responsable d’infections principalement chez les chevaux et chez les hommes travaillant à leur contact. L’objectif de cette étude était d’optimiser un test qui pourrait ensuite être utilisé pour comparer l’affinité relative de différentes souches de S. aureus pour les cornéocytes équins. Des cornéocytes ont été prélevés sur la peau du périnée de dix chevaux sains sur des disques adhésifs. Les disques ont été incubés à 37 °C avec une souche de S. aureusà chacune des trois concentrations [107, 108 et 109 CFU (colony forming units)/mL] et pour chacune des trois périodes d’incubation (45, 90 et 180 min). Après rinçages et colorations standards, les disques ont été examinés au grossissement 1000 et les zones contenant des cornéocytes confluents ont été photographiées. Le pourcentage de l’aire occupée par les bactéries adhérentes a été analyséà l’aide d’un logiciel de traitement et d’analyse d’images. Une analyse significative des images étaient nécessaire afin de distinguer les bactéries des grains de mélanines omniprésents dans les cornéocytes équins. Des méthodes objectives et subjectives ont été utilisées afin de déterminer les conditions optimales pour une adhérence spécifique sans introduction de facteurs de confusion. Une concentration bactérienne de 108 CFU/mL incubée avec les cornéocytes pendant 45 minutes produit une adhérence bactérienne maximale avec le moins d’agrégats bactériens. Des études futures pourront utiliser ces conditions pour optimiser les résultats de leurs tests.

Resumen

Las especies de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) causan infecciones serias de la piel y de tejidos blandos en seres humanos y en animales. SE han caracterizado muchas cepas de MRSA, y una en particular – señalada como cepa USA 500 – produce infecciones predominantemente en caballos y en la gente que trabajan con ellos. El propósito de este estudio era optimizar un análisis que se podría utilizar posteriormente para comparar la afinidad relativa de diversas cepas de S. aureus para los corneocitos equinos. Se colectaron corneocitos de la piel perineal de diez caballos sanos en discos adhesivos. Los discos fueron después incubados a 37 °C con una cepa de S. aureus de campo a tres concentraciones distintas (107, 108 y 109 unidades formadoras de colonias (CFU)/mL] y cada uno durante tres períodos de incubación (45, 90, y 180 minutos). Después de utilizar métodos de aclarado y tinción estándar, los discos fueron examinados a una magnificación 1000 × y las áreas que contenían corneocitos confluentes fueron fotografiadas. El porcentaje del área superficial ocupado por las bacterias adherentes era analizado usando análisis de imagen y software de análisis. Se necesitó un método de análisis muy detallado de color y espacio para distinguir bacterias de los gránulos de melanina presentes dentro de corneocitos equinos. Métodos objetivos y subjetivos fueron utilizados para determinar las condiciones óptimas para la adherencia específica sin introducir factores de confusión. Una concentración bacteriana de 108 CFU/mL incubada con los corneocitos durante 45 minutos produjo una adherencia bacteriana máxima con la menor cantidad de agrupamiento inter-bacteriano. Estudios futuros deben utilizar estas condiciones para el obtener el resultado óptimo del análisis.

Zusammenfassung

Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) verursachen ernstzunehmende Haut- und Weichteilinfektionen bei Mensch und Tier. Zahlreiche Stämme von MRSA sind bereits charakterisiert worden und einer im speziellen – als USA 500 Stamm bezeichnet – verursacht vor allem bei Pferden und bei Menschen, die mit diesen arbeiten, Infektionen. Das Ziel dieser Studie war es, einen Assay zu optimieren, der in der Folge verwendet werden konnte, um die relative Avidität verschiedener S. aureus Stämme für Pferdecorneozyten zu vergleichen. Es wurden Corneozyten von der perinealen Haut von zehn gesunden Pferden auf adhäsive Klebescheiben gesammelt. Die Scheiben wurden dann bei 37 °C mit einem S. aureus Feldstamm bei jeweils drei Konzentrationen [107, 108 und 109 Kolonie-bildende Einheiten (CFU)/mL] für jeweils drei Inkubationszeiten (45, 90 und 180 min) inkubiert. Nach standardisiertem Spülen und Färben wurden die Scheiben bei 1000 × Vergrößerung untersucht und die Stellen mit zusammenfließenden Corneozyten fotografiert. Der Prozentsatz der Oberfläche, welcher von festhaftenden Bakterien besetzt war, wurde mittels Bilderverarbeitungs- und Analyse Software analysiert. Eine spezielle ‘Colourspace’ Bildverarbeitung war nötig, um die Bakterien von ubiquitär vorkommenden Melaningranula, die in den Corneozyten der Pferde auftreten, zu unterscheiden. Objektive und subjektive Methoden wurden verwendet, um die optimalen Haftungsbedingungen festzulegen, ohne verwirrende Faktoren einzuschleusen. Eine bakterielle Konzentration von 108 CFU/ml erzeugte bei einer 45-minütigen Inkubation mit Corneozyten eine maximale bakterielle Adhäsion mit dem geringsten Ausmaß an Klumpenbildung der Bakterien. Zukünftige Studien sollten diese Bedingungen verwenden, um eine optimale Leistung des Assays zu erzielen.

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