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Epithelial-to-mesenchymal transition: immunohistochemical investigation of related molecules in canine cutaneous epithelial tumours

Authors


  • Sources of Funding: This study was self-funded.

  • Conflict of Interest: No conflicts of interest have been declared.

Laura Bongiovanni, Department of Comparative Biomedical Sciences, Faculty of Veterinary Medicine, University of Teramo, 64100 Teramo, Italy. E-mail: lbongiovanni@unite.it

Abstract

Background –  Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is a multistep process, important in tumour invasion and metastasis, characterized by loss of epithelial markers, redistribution of β-catenin and gain of mesenchymal markers.

Hyposthesis/Objectives –  Our aim was to investigate the immunohistochemical aberrant expression of cytokeratin, vimentin, survivin and heat shock protein 72 (Hsp72) in canine cutaneous epithelial tumours, to understand the association of expression of these molecules with features of malignancy and their role in the EMT phenotype.

Methods –  Ten canine squamous cell carcinomas (SCCs; one with lymph node metastasis), 30 canine hair follicle tumours (six pilomatricomas, eight infundibular keratinizing acanthomas, six trichoepitheliomas and 10 trichoblastomas) and five normal skin samples were investigated by immunohistochemistry using specific anti-vimentin, -cytokeratin, -survivin and -Hsp72 antibodies. A semi-quantitative method was used to analyse the results, as follows: 0 to <5%; ≥5 to <10%; ≥10 to <25%; and ≥25% of positive cells. Immunofluorescence was performed to investigate survivin–vimentin and survivin–Hsp72 colocalization in selected SCCs.

Results –  In malignant hair follicle tumours and SCCs, a reduced intensity of cytokeratin and increased survivin and Hsp72 expression were observed. In SCCs, loss of cytokeratin expression and vimentin immunolabelling, suggestive of the EMT phenotype, were evident in <5% of neoplastic cells in the front of tumour invasion. In the same areas, strong nuclear survivin and cytoplasmic Hsp72 staining was evident, often colocalizing. Only a few neoplastic cells in the front of tumour invasion showed vimentin–survivin colocalization.

Conclusions and clinical importance –  A possible simultaneous involvement of survivin and Hsp72 in tumour invasion and the multistep process of EMT of cutaneous epithelial tumours of dogs is suggested.

Résumé

Contexte –  La transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) est un processus multiple, important dans l’invasion et la métastase tumorale, caractérisée par une perte de marqueurs épithéliaux, une redistribution de ß-caténine et une augmentation des marqueurs mésenchymateux.

Hypothèses/Objectifs –  Notre but était d’étudier l’expression immunohistochimique abérrante de cytokératine, vimentine, survivine et Hsp 72 (heat shock protein 72) dans les tumeurs épithéliales cutanées canines et de comprendre l’association d’expression de ces molécules avec les critères de malignité et leur rôle dans le phénotype EMT.

Méthodes –  Dix carcinomes épidermoïdes canins (SCCs; dont un avec métastase ganglionnaire), 30 tumeurs folliculaires canines (six pilomatricomes, huit acanthomes infundibulaires kératinisants, six trichoépithéliomes et 10 trichoblastomes) et cinq échantillons cutanés normaux ont étéétudiés par immunohistochimie à l’aide anticorps spécifiques anti-vimentine, -cytokératine, -survivine et –Hsp72. Une méthode semi-quantitative a été utilisée pour l’analyse de résultats telle que : 0 à <5%; ≥5 à <10%; ≥10 à <25%; et ≥25% de cellules positives. Une immunofluorescence a été réalisée afin d’étudier la colonisation survivine–vimentine et survivine–Hsp72 dans les SCCs sélectionnés.

Résultats –  Dans les tumeurs folliculaires malignes et les SCCs, une expression d’intensité diminuée de cytokératine et augmentée de survivine et d’Hsp72 a été observée. Dans les SCCs, une perte d’expression d’immunomarquage de cytokératine et de vimentine, suggérant le phénoype EMT, était évident dans <5% des cellules néoplasiques sur le front de l’invasion tumorale. Dans les mêmes zones, une forte coloration de survivine nucléaire et de Hsp 72 cytoplasmique était évidente, souvent sur les mêmes localisations. Seules quelques cellules néoplasiques du front de l’invasion tumorale montraient une colocalisation vimentine-survivine.

Conclusions et importance clinique –  Une possible implication simultanée de survivine et de Hsp72 dans l’invasion tumorale et le procédé multiple d’EMT des tumeurs cutanées épithéliales des chiens est suggérée.

Resumen

Introducción –  la transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las células es un proceso con múltiples fases y de importancia en la invasión tumoral y en procesos de metástasis. Se caracteriza por la perdida de los marcadores de epitelio, redistribución de ß-catenina y adquisición de marcadores mesenquimales.

Hipótesis/objetivos –  nuestro propósito fue investigar la expresión aberrante de citoqueratina, vimentina, survivina y proteína del choque por calor 72 (Hsp72) mediante inmunohistoquímica en tumores epiteliales cutáneos caninos, para entender la asociación entre la expresión de estas proteínas con las características de malignidad y su papel en el fenotipo EMT.

Métodos –  diez carcinomas de células escamosas caninos (SCCs, uno con metástasis en un ganglio linfático), 30 tumores del folículo piloso caninos (seis pilomatricomas, ocho acantonas infundibulares queratinizantes, seis tricoepiteliomas y 10 tricoblastomas) y cinco muestras de piel normal se investigaron mediante inmunohistoquímica utilizando anticuerpos específicos antivimentina, anticitoqueratina, antisurvivina y anti-Hsp72. Se utilizó una técnica semicuantitativa para analizar los resultados, como se indica: 0 a <5%; ≥5 a <10%; ≥10 a <25%; y ≥25% de celulas positivas. Se utilizó inmunofluorescencia para investigar la colocalización de survivina-vimentina y survivina-Hsp72 en SCCs seleccionados.

Resultados –  en tumores foliculares malignos y carcinoma de células escamosas se observó una intensidad reducida de citoqueratina y una expresión incrementada de survivina y Hsp72. En SCCs la perdida de expresión de citoqueratina y la aparición de expresión de vimentina, sugestivas del fenotipo EMT fue observada en <5% de las células neoplásicas en el frente invasivo del tumor. En las mismas áreas se observó una expresión nuclear intensa de survivina y citoplásmica de Hsp72, a menudo colocalizadas. Solo unas pocas células neoplásicas en el frente invasivo del tumor mostraron colocalizacion vimentina-survivina.

Conclusiones e importancias clínica –  los resultados sugieren una posible implicación simultanea de la survivina y de Hsp-72 en la invasión del tumor y en las fases de transformación del proceso EMT en tumores epiteliales cutáneos caninos.

Zusammenfassung

Hintergrund –  Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist ein vielstufiger Prozess, die bei der Invasion von Tumoren und Metastasen eine wichtige Rolle spielt und charakterisiert wird durch einen Verlust der epithelialen Marker, einer Neuverteilung des ß-Catenins und dem Gewinn von mesenchymalen Markern.

Hypothese/Ziele –  Unser Ziel war es, die immunhistochemisch abweichende Exprimierung von Cytokeratin, Vimentin, Survivin und Heat Shock Protein 72 (Hsp72) bei epithelialen Hauttumoren des Hundes zu untersuchen und den Zusammenhang der Exprimierung dieser Moleküle mit Merkmalen von Malignität und ihrer Rolle für den EMT Phänotyp zu verstehen.

Methoden –  Zehn Plattenepithelkarzinome von Hunden (SCCs; eines davon mit Lymphknotenmetastasierung), 30 Haarfollikeltumoren von Hunden (sechs Pilomatricoma, acht infundibulär keratinisierende Akanthome, sechs Trichoepitheliome und 10 Trichoblastome) und fünf normale Hautproben wurden mittels Immunhistochemie unter Verwendung von Antivimentin, - cytokeratin, -survivin und –Hsp72 Antikörper untersucht. Eine semi-quantitative Methode wurde zur Analyse der Ergebnisse wie folgt, verwendet: 0 bis <5%; ≥5 bis <10%; ≥10 bis <25%; und ≥25% an positiven Zellen. Die Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um eine Survivin-Vimentin und Survivin-Hsp72 Kolonisierung in ausgewählten SCCs zu untersuchen.

Ergebnisse –  In maligen Haarfollikeltumoren und in SCCs wurde eine reduzierte Intensität von Cytokeratin und eine erhöhte Exprimierung von Survivin und Hsp72 beobachtet. Bei den SCCs war der Verlust der Exprimierung von Cytokeratin und der Immunmarkierung von Vimentin, welches auf den EMT Phänotyp schließen lässt, in <5% der neoplastischen Zellen in den vorderen Abschnitten der Tumorinvasion offensichtlich. In denselben Abschnitten war eine deutlich ausgeprägte nukleäre Survivin und zytoplasmatische Hsp72 Färbung, die sich oft am gleichen Ort befand. Nur wenige neoplastische Zellen in den vorderen Abschnitten der Tumorinvasion zeigten Vimentin-Survivin am selben Ort.

Schlussfolgerungen und klinische Bedeutung –  Hiermit werden Hinweise auf eine mögliche gleichzeitige Beteiligung von Survivin und Hsp72 bei der Tumorinvasion sowie Hinweise auf den vielstufigen Prozess der EMT von kutanen epithelialen Tumoren bei Hunden geliefert.

Abstract

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