SEARCH

SEARCH BY CITATION

Keywords:

  • Glomus mosseae;
  • Phytophthora infestans;
  • Phytophthora citricola;
  • real-time PCR;
  • amplicon quantification

Abstract

Specific primers and dual-labelled fluorogenic probes were designed for polymerase chain reaction (PCR)-based detection of both, mycorrhizal and pathogen DNA. Based on the on-line connection with an automated ABI Prism 7700 sequence detector, amplicon quantification was directly performed during the PCR. The starting copy numbers of target sequences present in each reaction were calculated by comparing the Ct-values of unknown samples to the Ct-values of standards with known amounts of DNA. The Ct-value depends on the input of starting copies and is defined as that cycle number at which a statistically significant increase in the reporter fluorescence can first be detected. DNA was extracted from 11 as well as 100 spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and quantified by using the fluorescent PCR technology. Furthermore, DNA of Phytophthora infestans, causal agent of late blight of potatoes, was quantified after extraction from artificially infected potato tubers and naturally infected field plants. Phytophthora citricola DNA, causing root-rot diseases, was quantified after isolation from artificially inoculated seedling roots of beech and oak. The results demonstrate that novel real-time PCR techniques are a powerful universal tool in modern phytopathological research.

Zusammenfassung

Real-time quantitative PCR: DNA-Bestimmung in isolierten Sporen des Mykorrhizapilzes Glomus mosseae und Nachweis von Phytophthora infestans sowie Phytophthora citricola in ihren Wirtspflanzen

Es wurden spezifische Primer und Fluoreszenzproben zum Nachweis von Mykorrhizapilz- sowie Pathogen-DNA entwickelt. Der Anstieg der im Verlauf der PCR gebildeten Produkte wurde während der Reaktion unter Verwendung des ABI Prism 7700-Gerätes direkt gemessen. Die automatische Quantifizierung der Amplicons fand anhand der Ct-Wertbestimmung statt, wobei ein Vergleich mit den Ct-Werten von Standardproben bekannter DNA-Konzentration erfolgte. Der Ct-Wert ist abhängig von der DNA-Menge und repräsentiert den Schritt im PCR-Zyklus, bei dem erstmalig ein Fluoreszenzsignal gemessen werden kann. DNA wurde aus 11 bzw. 100 Sporen des Mykorrhizapilzes Glomus mosseae extrahiert und mit Hilfe der beschriebenen PCR-Technik quantifiziert. Darüber hinaus ist die Vermehrung von Phytophthora infestans-DNA, dem Erreger der Kraut-und Knollenfäule bei der Kartoffel, in künstlich infizierten Kartoffelknollen sowie natürlich infizierten Feldpflanzen bestimmt worden. Außerdem wurde die DNA des Wurzelfäule-Erregers Phytophthora citricola in Wurzelproben von künstlich infizierten Keimlingen der Buche und Eiche quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, daß sich die neuen fluoreszenzgestützten Techniken zur direkten Quantifizierung von PCR-Produkten universell und leistungsfähig in der modernen phytopathologischen Forschung einsetzen lassen.